布鲁氏菌IV型分泌系统蛋白BMEII0735基因的原核表达

豆晓霞 莘海亮 张森 王俊峰 侯秀发

[摘要][目的]构建布鲁氏菌IV型分泌系统蛋白BMEII 0735基因的原核表达载体，进行表达、鉴定。[方法]本研究从羊种布鲁氏菌（B.melitensis） 043株的基因组中克隆BMEII 0735基因片段，亚克隆到pMD 19-T载体中，并测序，克隆至表达载体pET-28 a，构建重组质粒pET-28a -BMEII 0735，利用大肠杆菌进行表达，并进行Western-Blot检测。[结果]成功构建了pET-28a-BMEII 0735原核表达栽体，并在大肠杆菌中成功表达了BMEII 0735基因。经过SDS-PAGE检测，重组蛋白的分子量大约是64 KDa。经Western-Blot检测，BMEII 0735蛋白可与布鲁氏菌的阳性血清发生特异性反应，表明其具有良好的反应原性。[结论]本实验成功表达了布鲁氏茵IV型分泌系统蛋白BMEII 0735基因，并成功获得了BMEII 0735蛋白。BMEII 0735蛋白具有与布鲁氏菌自身蛋白相同的抗原性，为进一步研究布鲁氏菌病的鉴别诊断以及其免疫原性和保护性奠定了基础。

[关键词]布鲁氏菌;BMEII 0735;鉴定;原核表达;反应原性

[中图分类号] S852.61

[文献标识码]A

由布鲁氏菌（Brucella）所引起的一种人和多种动物共患的传染病，称为布鲁氏菌病，简称为布病，又称为波浪热或马尔他热。该病的传染源主要是患病动物和隐性患畜（包括野生动物），其中在布病流行病学上最为重要寄生为羊、猪和牛。羊在国内为主要传染源，其次为猪和牛。该病的病原——布鲁氏菌，是一种小球杆状菌，细胞内寄生，革兰氏染色阴性，没有鞭毛，不形成芽孢，专性需氧菌，主要寄生在巨噬细胞和胚胎滋养层细胞内，对外界环境抵抗力较强，在不同的介质里面可长期稳定存活，如在水中可生存5天-4个月，在尘埃里可存活21-72天，在鲜牛乳中可存活18个月之久，在土壤和粪尿中可生存5月有余，但布鲁氏菌对湿热、紫外线、常用消毒剂等比较敏感。布鲁氏菌病感染主要特征为人表现多汗、长期发热、肌肉和关节疼痛及肝、脾肿大等;母畜表现为生殖器官和胎膜发炎、流产、不育等;公畜表现为睾丸炎、附睾炎等，严重影响养殖业的经济发展和公共卫生健康。现下，能有效预防和控制布鲁氏菌病传播的疫苗还没有研制出来，也没有能够使得该病彻底康复的有效措施。就全世界范围而言，布鲁氏菌病广泛流行于很多国家，南美洲、地中海地区和亚洲等地是布鲁氏菌病的高发区。在中国，布鲁氏菌病波及全国大多数范围，自20世纪初，在我国重庆地区首次发现布鲁氏菌病以来，现已在全国绝大多数省、市区存在程度不一的流行，特别是北方农牧区，例如新疆、河南、内蒙古、东北三省等地，被《中华人民共和国传染病防治法》规定为二类疫病。并且随着畜牧业的发展以及近些年布病的流行趋势，世界范围内的布病的人畜疫情均出现了回升趋势，并且日趋严重。新疆等西部地区布鲁氏菌病动物的感染率为15%左右，有些养殖场的发病率为40%以上。布鲁氏菌侵染宿主细胞涉及黏附、侵入、转运、传播及复制多个复杂过程。大量研究表明，布鲁氏菌的分泌蛋白能够使机体获得有效的免疫应答，可作为候选靶标进行布鲁氏菌病的诊断性抗原的筛选和亚单位疫苗的研制。细菌的分泌蛋白有着良好的桥梁作用，使得细菌和机体之间进行互相作用，被认为是最有潜力的保护性抗原。布鲁氏菌大多数的分泌蛋白，在侵入宿主细胞的过程中都有着重要的作用，但是其具体的分子作用机制，目前还不清楚。有结果显示，布鲁氏菌IV型分泌系统蛋白在布鲁氏菌侵入宿主细胞的过程中起着重要的作用，能够使机体受到刺激，产生较好的免疫应答。因为其具有该特点，布鲁氏菌IV型分泌系统蛋白在布病的鉴别诊断和有效的疫苗研制中有着非常重要的作用和研究价值。本研究选取羊布鲁氏菌IV型分泌系统蛋白BMEII 0735基因作为研究对象，构建BMEII 0735基因的原核表达载体，通过Western-Blot检测其反应原性，为进行布鲁氏菌的保护性抗原分子筛选、疫苗免疫与布鲁氏菌鉴别诊断靶点的研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细菌和载体

石河子大学动物科技学院，动物疾病防控重点实验室提供布鲁氏菌羊种043株、菌株E.coli DH 5 a、pET-28 a载体菌株、BL21（DE 3）菌株;Promega公司购买pMD 19-T载体。

1.2 主要试剂

石河子大学动物科技学院/动物疾病防控重点实验室保存的布鲁氏菌羊种阳性血清;Merck公司购买诱导剂IPTG;由大连宝生物工程有限公司提供限制性内切酶（BamH I/Xho I）、T4连接酶和DNA marker;细菌质粒小提取试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限责任公司;蛋白Marker、HRP标记的兔抗羊IgG、购自北京康为世纪生物科技有限责任公司;BCA蛋白质定量试剂盒购自生工生物工程（上海）有限股份公司;剩余试剂均为本实验室常用分析纯度的产品。

1.3 目的基因扩增

登录GeneBank，查找布鲁氏菌（NC-003317）BMEII 0735的基因序列，設计引物，由北京六合华大基因有限公司进行合成，序列见表1。

布鲁氏菌羊种043分离株的灭活菌液（90℃金属浴灭活30min）做为模板，进行菌液PCR扩增，PCR反应体系（20 uL）见表2，反应条件见表3。反应结束后，PCR产物直接进行1%琼脂糖凝胶凝胶电泳或4℃保存。回收目的基因片段，并与载体pMD19-T在16℃水浴条件下进行连接，连接体系（10 uL）见表4，构建重组质粒pMD 19-T-BMEII 0735。再将构建好的重组质粒转化至E.coli DH 5 α感受态细胞，在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，进行菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆，并将提取的质粒送往上海生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.4 构建BME110735基因原核表达载体

将测序正确的pMD 19-T- BMEII 0735质粒和pET-28 a载体用BamH I和Xho I限制性內切酶进行双酶切处理，目的片段和酶切后的线性pET-28 a载体用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。将线性pET-28 a载体和目的片段，在16℃水浴条件下用T4连接酶连接，连接产物转化至E.coli BL 21（DE 3）感受态细胞，经LB固体培养基（卡那抗性）筛选阳性克隆，进行菌液PCR验证和酶切鉴定。

1.5 重组蛋白表达及表达条件的优化

将筛选出的阳性克隆菌置于LB液体培养基中，200r/min、37℃的培养箱中培养过夜，将过夜培养的菌液按1：100的比例，接种至新鲜的LB液体培养基中，200r/min、37℃继续培养1h左右，使其OD值为0.4-0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂（IPTG）浓度（终浓度为0.2mM，0.6mM，1.0mM）、诱导不同时间（0h，4h，6h，8h），收集菌体。取1ml菌液2000r/min离心后，弃掉上清，并在离心管中按照1：4的比例加入稀释后的1×SDS蛋白上样缓冲液，在振荡器上震荡，使菌体和蛋白上样液充分混匀，在金属加热器上100℃加热10 min，取20ul样品进行15%蛋白电泳。观察电泳结果。筛选目的基因的最佳表达条件，并以最佳的诱导表达条件，进行蛋白大量诱导表达，并采用AKTA蛋白纯化系统进行蛋白纯化，进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.6 重组蛋白的Western-Blot检测

筛选出蛋白的最佳表达条件后，以最佳诱导条件诱导重组蛋白表达，并对重组蛋白进行纯化，经SDS-PAGE电泳后，将重组蛋白转移到NC膜上，以200mA的电流转膜1h。再将NC膜放入杂交瓶（预先用TBST缓冲液洗涤）中。37℃封闭2h，NC膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次7 min。加入1：500比例稀释的经石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室鉴定的布鲁氏菌羊种阳性血清，37℃孵育2h，NC膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次7min，然后加入1：5000比例稀释的辣根过氧化氢酶标记的兔抗绵羊IgG，37℃孵育2h，NC膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次7min。避光条件下，DAB显色剂进行显色后拍照。

2 结果

2.1 目的基因的扩增及酶切鉴定

NCBI中记录的羊种布鲁氏菌BMEII0735基因的片段大小为1578 bp，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后，与实际的大小一致，如图l所示。用相应的（ BamH I/Xho I）限制性内切酶进行双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，得到大小与预期结果相符合的基因条带。表明羊种布鲁氏菌IV型分泌系统蛋白BMEI10735基因已经成功插入pET-28 a表达载体中，如图2所示。

2.2 重组蛋白表达条件的优化

为探寻重组蛋白表达的最佳诱导剂浓度和诱导时间，分别在诱导时间不变的前提下，设置诱导剂浓度梯度，筛选最佳诱导剂浓度;在诱导剂浓度不变的前提下，设置时间梯度筛选最佳诱导时间。结果显示，在诱导剂IPTG的终浓度为1 mmol/L诱导8h条件下，重组蛋白表达量最高，如图3所示。重组蛋白大量诱导表达后，经AKTA蛋白纯化系统进行蛋白纯化。SDS-PACE分析表明，纯化后的蛋白条带清晰，无杂带，显示纯化效果较好，结果如图4所示。

2.3 Westem-Blot检测

将诱导8h后的重组蛋白纯化后，进行Western-Blot检测，200mA恒流电流下转膜1h，可见明显的阳性条带。结果表明，诱导得到的重组蛋白能被HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体识别，且大小与pET-28分子质量加上目标分子蛋白质量的重组蛋白总分子质量相符，结果如图5所示。

3 讨论

在我国，将布鲁氏菌病列为职业病。2019年，布鲁氏菌病又被农业农村部列为畜牧业强制免疫的传染病之一，可见布病的危害影响。防控布鲁氏菌病的关键在于疫苗免疫和检疫净化。目前，国内市面上现有的布病疫苗虽然有一定的免疫效果，但其免疫效果并未达到我们所期望的高度，重点是不能区分布鲁氏菌野毒感染和疫苗免疫，为布病的检疫净化带来重重困难。

自2002年羊种布鲁氏菌16M参考基因组测序工作完成以来，已经有300多株布鲁氏菌基因组完成了测序，其中有16株基因组已经进行了精细的物理图谱绘制。目前，随着部分布鲁氏菌菌株的基因组序列测序的完成，使我们在分子层面研究布鲁氏菌的致病机理有了进一步的提高和发展。总之，布鲁氏菌与易感动物群之间的相互作用是一个非常复杂的过程。本文通过构建布鲁氏菌BMEI10735基因的原核表达载体并对其反应原性进行鉴定，有助于进一步了解布鲁氏菌蛋白质的功能，为布鲁氏菌的鉴别诊断研究和生物信息学分析提供参考，为进一步探究布鲁氏菌的分子致病机制以及布鲁氏菌的鉴别诊断奠定了基础。

[参考文献]

[1]徐丽，刘松财，张永亮.蛋白质组学的研究进展[J].现代农业科技，2007（22）.

[2]孙志华，刘良波，张豫等，布鲁氏菌外膜蛋白VirB4在感染胚胎滋养层细胞中的作用分析[J].中国人兽共患病学报，2014（10）.

[3]宫晓炜，周继章，布鲁菌外膜蛋白OMPIO表达及其抗原性的研究[J].动物医学进展，2009（12）.

[4] Abdalla A，Hamid M E.Comparison of conventional and non-conventional techniques for the diagnosis of hovine brucellosis inSudan[J]. TROPICAL ANIMAL HEALTH AND PRODUCTION， 2012（06）.

[5]纪太旺，张辉，郭飞，等，布鲁氏菌043强毒株BR0524基因缺失突变株的構建与毒力的初步评价[J].石河子大学学报（自科版），2014（05）.

[6]张豫，张辉，张艳，等布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定[J].石河子大学学报（自科版），2013（01）.

[7] Ruchi Shrivastava. Jeff F Miller. Virulence Factor Secretion hy BordetellaSpecies[J]. Current Opinion in Microbiology，2009（01）.

[8] Kokoglu O F，Hosoglu S，Ceyik M F，et al. Clinical and laboratoryfeatures of brucellosis in two university hospitals in Southeast Turkey.[J].Tropical Doctor， 2006（ 01）.

[9]赵天靖，贾晓晓，焦寒伟，等，布鲁氏菌外膜蛋白2基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析[J].中国畜牧兽医，2014（09）.

[10]邢进，王金锋，赵宝华，布鲁菌病及其诊断方法研究进展[J].动物医学进展.2009（03）.

[11]赵晓燕，朱亮，姜德玉，等.布鲁菌BMEI1829基因的原核表达、蛋白纯化及动物免疫试验[J].动物医学进展，2010（10）.

[12] Cassataro J， Estein SM， Pasquevich KA， et a/. Vaccination with theRecombinant Outer Membrane Protein 31 0r a Derived 27-Amino-Acid Synthetic Peptide Elicits a CD4T Helper l Response That Protectsagainst Infection[J]. Infection and immunity，2005（ 12）.

[13]赵岩，李明，胡福泉.细菌的IV型分泌系统[J].生命的化学，2011（01）.

[14]丁家波，毛开荣，程君生，等.布氏杆菌病疫苗的应用和研究现状[J].微生物学报，2006（05）.

[15]Wattam AR， Williams KP， Snyder EE， et a/. Analysis of Ten BrucellaCenomes Reveals Evidence for Horizontal Gene Transfer Despite aPreferred Intracellular Lifestyle[J]. Journal of Bacteriology. 2009（11）.