猪圆环病毒2 型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗与猪瘟活疫苗混合免疫效果评价

朱巧艳，张国良，翟路峰，金云云，贺 笋，宋国亮，李俊辉，焦金波，王尊宝，廖永洪*，田克恭*

（1.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000；2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000；3.天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011;4.洛阳惠中生物技术有限公司，河南 洛阳 471000）

猪圆环病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）和猪肺炎支原体（Mycoplasma Hyopneumoniae，Mhp）作为断奶后多系统衰竭综合征（Post-weaning multi⁃systemic wasting syndrome，PMWS）和猪呼吸道综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）两大重要的原发病原，给全球养殖业带来严重影响[1]。猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病，为国家一类动物疫病，严重危害我国养猪业[2]。临床上常以疫苗免疫作为主要防控措施[1-3]，对于PCV2疫苗和CSF 疫苗的免疫已被列入猪场的常规免疫计划。由于猪场疫病复杂，在实际生产中大多通过疫苗接种使得猪群得到保护，且不同的疫苗按照不同免疫程序分别接种，给猪群造成多次应激，对猪群的生长造成影响，同时也增加了人工成本。为了减少猪群应激次数，节省人工，结合临床实际生产，许多学者对不同疫苗进行单独免疫或同时免疫的效果进行研究[4-7]，其中朱子健等提出用PCV2 灭活疫苗作为CSFV 活疫苗的稀释剂进行免疫，均可产生针对两种病原的免疫抗体，且两种抗体间互不影响[4]，这些研究为临床猪场免疫程序优化提供了一定的参考依据。

作为国内第一个上市的PCV2-Mhp 二联灭活疫苗，一针双防，给养殖户带来便利[8]。为了使疫苗更符合临床实际应用，进一步减少猪群应激，降低防疫成本，本研究拟用PCV2-Mhp 二联灭活疫苗作为稀释剂稀释CSF 活疫苗，稀释后不同时间测定CSFV 活疫苗含量，以及对仔猪免疫后免疫效果进行综合评价，期望达到能联合应用的效果，为这3 种病原的疫苗免疫程序优化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗、菌毒种、细胞与实验动物 水性佐剂PCV2、Mhp 二联灭活疫苗（SH 株+HN0613 株），以下简称圆支二联苗，40 mL/瓶；猪瘟活疫苗（传代细胞源），以下简称CSF 活疫苗，20 头份/瓶，均由洛阳惠中生物技术有限公司制备。PCV2 SH 株、Mhp 强毒YC 株和ST 细胞，均由国家兽用药品工程技术研究中心繁殖和保存。14日龄～21日龄健康仔猪45头，经确认PCV2 抗 体、Mhp 抗 体、CSFV 抗 体、PCV2 和猪 繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）均为阴性，购自洛阳周边农户。

1.2 主要试剂 Mhp ELISA 抗体和CSFV ELISA 抗体检测试剂盒均购自IDEXX 公司；PCV2 ELISA 抗体检测试剂盒购自荷兰Biocheck 公司；PCV2 PCR 和PRRSV RT-PCR 检测试剂盒均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；猪瘟特异性阳性血清由普莱柯生物工程股份有限公司提供；FITC 标记的兔抗猪IgG 购自Sigma公司。

1.3 不同稀释液稀释CSF 活疫苗后CSFV 含量测定 将圆支二联苗充分摇匀，用注射器抽取5 mL 注入CSFV 活疫苗瓶中完全溶解，轻摇充分混匀。抽取溶解后的混合疫苗注入圆支二联苗瓶中，轻摇充分混匀。将充分混匀的混合疫苗分别在室温（25 ℃）放置0、1 h、2 h 取样进行CSFV 含量测定。同时取CSF 活疫苗用配套稀释液按同样方法稀释，稀释后CSFV 活疫苗分别在室温（25 ℃）放置0、1 h、2 h 取样，用3% α-MEM 维持液作10 倍倍比稀释，取10-2、10-3、10-43个稀释度，与ST细胞同步接种于96孔细胞培养板，每个稀释度接种6 孔，其中稀释好的样品0.1 mL/孔，ST 细胞0.1 mL/孔，同时设正常ST 细胞为对照，37 ℃5% CO2，培养观察72 h，用冷丙酮固定细胞，以猪瘟特异性阳性血清（1 300）为一抗，FITC 标记的兔抗猪IgG（1 500）为二抗，采用间接免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有CSFV 阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Reed-Muench 法计算病毒TCID50。

1.4 动物实验 将45 头健康仔猪，随机分为9 组，每组5 头，分组及免疫试验设计见表1。其中第1～5组仔猪均颈部肌肉注射圆支二联苗，2 mL/头。首次免疫后14 d 二免，二免时第1～3 组仔猪均颈部肌肉注射圆支二联苗和CSF 活疫苗混合疫苗，2 mL/头；第4、5 组仔猪均颈部肌肉注射圆支二联苗，2 mL/头；第6 组实验猪于首次免疫后14 d 颈部肌肉注射CSF 活疫苗，2 mL/头；第7～9 组仔猪不免疫。所有仔猪均于相同条件下隔离饲养。

1.5 PCV2 免疫效力评价 二免后21 d（首免后35 d），第1、4、7组仔猪用PCV2 SH株病毒液（106.0TCID50/mL）参考彭伍平等的攻毒方法攻毒[9]，第9 组实验猪作为空白对照，既不免疫也不攻毒。攻毒后连续观察25 d迫杀，采集肺门淋巴结或腹股沟淋巴结，利用免疫组织化学（IHC）PCV2 抗原检测，根据体温、平均相对日增重和IHC PCV2 抗原检测结果进行结果判定。仔猪发病判定指标如下：a、体温升高（≥40 ℃），持续3 d 以上；b、免疫组仔猪平均相对日增重高于攻毒对照组（p<0.05），相对日增重=（攻毒后第25 d 体重-攻毒首日体重）÷25÷攻毒首日体重，免疫组与空白对照组间平均相对日增重差异显著即判为发病；c、IHC检测淋巴结PCV2 抗原；上述3 项指标符合任意2 项即判定为发病。空白对照组仔猪应全部正常，攻毒对照组至少4头发病，疫苗免疫组至少4头正常。

表1 动物分组及试验设计Table 1 Animal grouping and experimental design

1.6 Mhp 免疫效力评价 二免后28 d（首免后42 d），第2、5、8 组仔猪用Mhp 强毒攻毒，每头气管注射10 mL，含100 个最小发病剂量（MID）。攻毒后28 d 迫杀仔猪，取出肺脏，按28 分法对仔猪的气喘病肺病变（肉样变、胰样变）进行评分[10]，计算肺炎病变减少率。肺炎病变减少率=（攻毒对照组仔猪肺炎病变平均得分-免疫组仔猪肺炎病变平均得分）/攻毒对照组仔猪肺炎病变平均得分×100%。

1.7 CSFV 抗体监测 第3、6 组仔猪分别在混合疫苗和CSF 活疫苗免疫前、免疫后2、3、4、6、8 周采血，共6 个时间点；分离血清后利用CSFV ELISA 抗体检测试剂盒检测血清中的CSFV 抗体，按照说明书标准，CSFV阻断率≥40%判为抗体阳性。

1.8 数据统计与分析 利用SPSS21 软件对仔猪平均相对日增重数据进行统计分析，p<0.05 表示差异显著，p>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 CSFV 含量测定结果 经不同稀释液稀释的混合疫苗和CSF 活疫苗分别在室温（25 ℃）放置0、1 h、2 h取样测定CSFV含量。结果显示，混合疫苗和CSF 活疫苗放置2 h 内CSFV 含量未见下降（表2），表明圆支二联苗作为稀释剂稀释CSFV 活疫苗CSFV 含量不受影响。

2.2 PCV2 免疫效力评价结果 PCV2 攻毒后第25 d进行结果判定，结果混合疫苗、圆支二联苗对仔猪的免疫保护率均为80%，详细结果见表3。表明圆支二联苗稀释CSF 活疫苗后，CSF 活疫苗不影响圆支二联苗PCV2的免疫效力。

表2 CSFV 含量测定结果Table 2 The results of CSFV titers determination

表3 PCV2 免疫效力评价结果Table 3 The results of PCV2 efficacy evaluation

2.3 Mhp 免疫效力评价结果 Mhp 攻毒后第28 d 对仔猪迫杀，取出肺脏，按28 分法对试验猪的气喘病肺病变（肉样变、胰样变）进行评分，计算肺炎病变减少率。结果显示，混合疫苗、圆支二联苗的肺炎病变减少率分别为73.1%、75.0%（表4）。表明圆支二联苗稀释CSF 活疫苗后，CSF 活疫苗不影响圆支二联苗Mhp的免疫效力。

2.4 CSFV 抗体监测 利用CSFV ELISA 抗体检测试剂盒检测圆支二联苗+混合疫苗组（第3组）和CSFV 活疫苗组（第6 组）不同时间点采集的血清中CSFV 抗体。结果显示，两个免疫组在混合疫苗和CSFV 活疫苗首次免后3 周所有仔猪CSFV 抗体均阳转，在混合疫苗和CSF 活疫苗首次免疫后6 周CSFV 抗体达到峰值（图1）。表明圆支二联苗稀释CSF 活疫苗而成的混合疫苗免疫一次与CSF 活疫苗免疫一次均能够刺激仔猪产生良好的CSFV抗体水平。

表4 Mhp 免疫效力评价结果Table 4 The results of Mhp efficacy evaluation

图1 免疫猪血清中CSFV 抗体检测结果Fig. 1 The results of CSFV antibody detection in serum

3 讨 论

有报道称PCV2 感染可以造成猪免疫系统损害，从而抑制猪免疫应答产生，影响CSF 疫苗免疫时抗体的产生[11-12]，作为危害养殖业的两大病原，临床上早已把CSF 疫苗和PCV2 疫苗纳入到猪场常规免疫程序中。Mhp 作为PRDC 主要原发病病原之一，给猪场带来的经济损失也不容忽视，越来越多的猪场开始重视Mhp 疫苗的免疫。针对这3 种病原，早期免疫程序中至少需要免疫3 种单苗才可达到预防疫病的目的，随着圆支二联苗上市，免疫圆支二联苗和CSF 活疫苗2种疫苗即可达到相同目的，但是免疫程序仍有进一步优化的空间。

本研究为了进一步优化猪群免疫程序，降低猪群免疫应激次数，尽可能降低防疫成本，本研究使用的圆支二联苗是水性佐剂，疫苗本身能够作为稀释剂稀释CSF活疫苗，在室温放置2 h监测CSFV 含量未见下降，疫苗混合后2 h 内CSFV 含量不受影响，这样可以给临床疫苗混合使用提供时间保证。

为了在仔猪上评价圆支二联苗和CSF 活疫苗混合使用效果，本实验通过筛选获得PCV2 抗体、Mhp 抗体、CSFV 抗体、PCV2 病原和PRRSV 病原均为阴性的健康仔猪，在排除可能影响疫苗效果的外源病原干扰的情况下进行混合疫苗的免疫效果评价。其中PCV2 和Mhp 的免疫效力，均采用免疫攻毒方法进行评价，结果圆支二联苗和CSFV 活疫苗混合使用的效果与圆支二联苗单独使用的效果相当，均能针对PCV2和Mhp感染产生较好的攻毒保护效果；对于CS⁃FV 的免疫效力，采用CSFV 抗体监测的方法进行评价，结果圆支二联苗和CSF 活疫苗混合使用和CSF 活疫苗单独使用均能够刺激机体产生较好的CSFV 抗体水平，两者免疫效果相当。

本研究结果表明圆支二联苗可以作为稀释剂稀释CSF 活疫苗，一次性注射免疫后疫苗各自免疫效力均不受影响，从而为圆支二联疫苗稀释CSF 活疫苗的联合应用方式提供实验依据，为其临床推广应用奠定了基础。