一株新型三源重配H1N2 亚型猪流感病毒的进化分析及对小鼠的感染性研究

钟 秋，张丹丹，宋祖晨，孟 飞，陈 艳，乔传玲，陈化兰，曹允考，杨焕良*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；2.东北农业大学动物医学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

猪流感（Swine influenza，SI）又称猪流行性感冒，是由正黏病毒科流感病毒属的猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难为主要特征。SIV 感染影响患猪的生产性能和疫病抵抗力，极易并发或继发其它病原微生物感染。同时，猪的呼吸道上皮细胞同时具有人和禽流感病毒的受体，因此是人和禽流感病毒的共同易感宿主，被称为流感病毒的“混合器”[1]，对猪流感的研究具有重要的公共卫生学意义。

目前世界上流行的SIV 主要有H1N1、H1N2 和H3N2 三种亚型。1978 年，日本首次在猪群中分离到H1N2 亚型流感病毒[2]。此后世界其它地区，包括亚洲、欧洲和北美地区都分离到了这一亚型病毒[3-5]。2009 年4 月，H1N1/2009（甲型H1N1）在全球爆发后很快传入猪群，并且和原有的SIV 发生基因重配，产生了多种含有H1N1/2009 基因节段的H1N2亚型SIV[9-14]。我国于2004 年开始持续在猪群中分离到不同基因节段来源组成的H1N2 亚型SIV[6-8]。调查我国SIV 在广西猪群中的流行毒株情况时，本实验室于广西某猪场中采集鼻腔拭子样品并分离到一株H1N2 亚型SIV，本研究通过对该病毒株进行全基因组的序列测定，揭示其遗传演化关系及分子特征，并以BALB/c 小鼠为模型动物，评估病毒的致病性，为SIV的流行病学、致病性和防控研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病毒分离株、实验动物及主要试剂 A/swine/Guangxi/238/2018（H1N2）株流感病毒，简称GX238株，为本实验室2018 年冬季从广西某猪场临床健康猪200份鼻腔拭子中按照参考文献[13]分离，经测定其鸡胚半数感染量（EID50）[14]为7.32 Log10EID50/0.1 mL，-70 ℃保存。实验用10 日龄SPF 鸡胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；6 周龄的雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

病毒RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；M-MLV 反转录试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；TaqDNA Polymerase PCR 扩增酶购自北京拓派科技有限公司；PCR 产物胶回收试剂盒购自美国Omega 公司；测序反应试剂盒Big⁃Dye Terminator3.1 购自美国ABI 公司；所用引物由吉林库美生物科技有限公司合成。

1.2 全基因组测序及遗传进化分析 按照RNA 提取试剂盒说明书提取病毒RNA，以通用引物Uni12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）作为反转录引物，将病毒RNA 反转录为cDNA。对病毒的8 个基因节段分别用节段特异性引物扩增，引物序列及反应程序参照文献[13]。利用胶回收试剂盒回收、纯化目的节段。

按照BigDye Terminator 测序试剂盒说明书对病毒各节段进行序列测定，并利用SeqMan 软件进行全序列拼接。测序结果利用MegAlign 软件进行同源性比较，并用MEGA7.0 软件构建HA、NA、M 和PB2等基因的系统进化树。

1.3 病毒对BABL/c 小鼠的感染性试验 将6 周龄的雌性BALB/c 小鼠随机分为两组，感染组的8 只BALB/c 小鼠利用干冰轻度麻醉后，以50 μL/只含有106EID50GX238 株病毒鼻腔感染；对照组5 只小鼠，采用同样的方法接种50 μL 无菌PBS。感染后每组选取5 只实验小鼠每日记录小鼠的体质量变化及死亡情况，对体质量比例下降30%的动物实施安乐死，并判定死亡。在感染后的第3 d 取感染组剩余3 只小鼠，无菌采集脑、鼻甲、脾、肾和肺匀浆处理后接种10 日龄鸡胚进行病毒滴定，分析病毒在小鼠体内组织与脏器的复制情况。

2 结 果

2.1 病毒分离株全基因组序列测定及同源性分析对GX238 株病毒提取RNA，经RT-PCR 分节段扩增后，获得预期大小的目的条带，对PCR 产物胶回收、纯化进行测序，利用SeqMan 软件对序列结果进行全基因拼接。应用BLAST 程序对拼接好的完整序列进行比对，得到与分离株8 个节段核苷酸序列同源性最高的8 个病毒株（表1）。结果显示HA 基因与分离自美国的A/swine/Indiana/A01943834/2016（H1N2）核苷酸相似性最高，NS 基因与A/swine/Indiana/A01727685/2015（H1N2）核苷酸相似性最高，其余节段均与A/swine/Indiana/A01812050/2015（H1N2）核苷酸相似性最高，相似性均可达98.9%以上，表明病毒可能从A/swine/Indiana/A01812050/2015（H1N2）类病毒进化而来。

表1 GenBank 中与GX238 株各基因节段开放阅读框核苷酸序列同源性最高的病毒株Table 1 Percentage nucleotide homology of open reading frame in each gene segment of influenza viruses closely related to the viruses with the highest nucleotide identity with GX238 strain in GenBank

2.2 HA 序列及其进化分析结果 对GX238 株HA 基因进行分析，结果显示其编码区全长1 698 nt，共编码565 个氨基酸。HA 蛋白由HA1 和HA2 两部分组成，这两个亚单位由一个碱性氨基酸R 链接，碱性裂解氨基酸位点为PSIQSR↓G，符合低致病性流感病毒的特征。该毒株HA 基因分别有28NST30、40NVT42、71NCS73、142NHT144、176NLS178、497NGT499和556NSS5587 个潜在糖基化位点。根文献[6]中的5个HA蛋白抗原位点区域，包括Sa（aa128、aa156～aa160、aa162～aa167）、Sb（aa187～aa198）、Cal（aa169～aa173、aa206、aa238）、Ca2（aa140～aa145、aa224）、Cb（aa78～aa83）与同源性最高病毒株A/swine/Indiana/A01943834/2016（H1N2）进行比对，结果显示GX238 株HA 蛋白仅在Sa 抗原位点区域呈现158K 的分子特征，其余各抗原位点与比对毒株完全一致。HA 基因的进化分析可以将H1N1流感病毒分为3 个大的分支，包括经典型（Classical）H1N1 SIV、欧亚类禽型（Eurasianavian-like）H1N1 SIV、人季节性（Humanseasonal）H1N1流感病毒，H1N1/2009 分支位于Classical H1N1 大分支内（图1），遗传进化分析表明GX238 株HA 基因可能来源于以A/Bris⁃bane/59/2007 株为代表的2009 年之前人季节性H1N1流感病毒。

图1 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分离株HA 基因进化树Fig.1 The phylogenetic treeof HA gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

2.3 NA 序列及其进化分析结果 对GX238 分离株NA 基因分析，结果显示其编码区全长1 410 nt，共编码469 个氨基酸，共有61NKT63、70NTT72、86NWS88、93NIT95、146NDT148、234NGT2366 个潜在糖基化位点。NA基因头部区域未发生缺失，具有275H 和295N 的分子特征，表明对奥司他韦类药物敏感。NA 基因进化树显示，可以将H1N2 亚型SIV 的NA 基因划分为两个分支，北美-亚洲型（NorthAmerican-Asian）H1N2 和欧洲型（European）H1N2，而GX238 株NA 位于北美-亚洲分支（图2）。

图2 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分离株NA 基因进化树Fig.2 The phylogenetic tree of the NA gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

2.4 内部基因分子特征和进化分析 A 型流感病毒PB2 基因E627K 和D701N 位点的突变可以增加流感病毒对哺乳动物的致病性和病毒在哺乳动物间的传播能力，T271A 突变能显著增强PB2 多聚酶活性，增加对哺乳动物感染能力[15-17]。本研究对GX238 株PB2 蛋白的627 和701 位点分析显示均未出现致病性增强突变，而T271A 突变，表明GX238 株有毒力增强的可能。M2 蛋白31 位为N，可能产生了对金刚烷胺类药物的耐药性[18]。GX238 株病毒内部基因的进化结果显示，M 基因来源于H1N1/2009 人流感病毒（图3），PB2 基因位于北美三重配H1N2 亚型代表株SW/He⁃bei/10/2006（H1N2）分 支（图4），其 它 内 部 基 因PB1、PA、NP、NS 在进化树中位置和PB2 基因相同，均位于SW/Hebei/10/2006（H1N2）分支内。

图3 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分离株M 基因进化树Fig.3 The phylogenetic tree of the M gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

图4 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分离株PB2 基因进化树Fig.4 The phylogenetic tree of PB2 gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

2.5 分离株对BALB/c 小鼠的感染性试验结果

2.5.1 小鼠体质量变化 通过鼻腔感染小鼠GX238株后第2 d 开始检测小鼠体质量，结果显示小鼠体质量从感染后第2 d 持续下降至第9 d。其中实验组检测的5 只小鼠中有2 只体质量下降超过30%，对其实施安乐死，并判定为死亡；而对照组小鼠无明显临床症状，体质量呈上升趋势（图5）。上述结果表明以106EID50的病毒通过鼻腔感染，该病毒对小鼠有40%的致死率。以对小鼠100%致死、部分致死和不致死为高、中和低致病性判定标准，表明该病毒对小鼠呈现中等致病力。

图5 小鼠感染分离病毒后的体质量变化Fig.5 Body weight change of mice inoculated with the virus

2.5.2 病毒在小鼠体内的复制情况 病毒感染后第3 d 每组迫杀3 只小鼠，进行脏器内病毒含量滴定。结果显示，在脑、肾和脾中均未检测到病毒，病毒可在小鼠肺脏和鼻甲中有效复制，病毒滴度分别达6.3 Log10EID50/mL、4.8 Log10EID50/mL（图6，虚线为检测限）。表明该病毒可以在呼吸道有效复制，而尚未获得感染其它组织和器官的能力。

图6 感染3 d 后小鼠脏器病毒滴定结果Fig. 6 Virus titration in organs of the mice at 3 days post inoculation

3 讨 论

目前H1N2 亚型是我国猪群中流行SIV 的主要亚型之一，对养猪业造成了持续的危害。Wang 等人在疑似患猪流感病猪体内分离到A/swine/Fujian/F1/2010（H1N2）[19]；2012 年～2016 年期间，有研究表明在浙江、广西和辽宁分离到含有H1N1/2009 基因的基因重配H1N2 SIV，因其含有人流感病毒基因，在危害养猪业健康发展的同时，也对人类健康造成潜在的威胁[13-14]。本研究通过对GX238 株进行遗传进化分析，发现其HA 基因来源于2009 年之前人季节性H1N1 流感病毒，M 基因来源于H1N1/2009 流感病毒，NA 和其他内部基因均来源于北美三重配H1N2 SIV。由此得出GX238 株是由2009 年之前人季节性H1N1、北美三重配H1N2 和H1N1/2009 3 种不同基因型的病毒发生基因重配而形成的新型三源重配H1N2 亚型SIV。我国猪流感流行病学研究表明，2009 年之前人群流行的H1N1 流感病毒可以感染猪[20]，但没有形成稳定的遗传谱系[21]。在2009 年4月之后，2009 年之前的人季节性流感病毒逐渐被H1N1/2009 大流行的病毒株取代，因此猪群也失去了感染这一类病毒的直接来源。然而在北美地区，人季节性流感病毒通过基因重配获得了在猪群中稳定遗传的能力，对养猪业和人类健康造成了持续的威胁。通过BLAST 软件在线分析表明GX238株8个节段和我国病毒株同源性相对较低，而与美国的2015年～2016 年期间分离的H1N2 亚型SIV 序列高度同源。以上分析表明该病毒并非由我国流行的SIV 和H1N1/2009 重配形成，推测可能是由美国输入型病毒进化而来。由于该株病毒HA 和M 基因来源于人流感病毒，因此又增加了其感染人的可能性。在2011 年后，美国出现多个H1N2 亚型流感病毒感染人的病例，病毒的基因组成与该分离株相似，都具有H1N1/2009 株的M 基因[22]。致病性试验表明该株病毒可致死小鼠，呈现中等致病力，对人类健康和公共卫生安全的威胁更不可忽视。在今后的监测工作中，仍需密切关注该类病毒在我国猪群中的分布与流行情况。本研究结果表明输入型SIV 持续对我国猪群造成威胁，对于该亚型的SIV，是否在猪群中适应而具有一定的流行趋势，然后再由猪传染给人，需要密切关注。本研究凸显了加强进口动物及动物产品检疫措施和在世界范围内开展猪流感监测的必要性。