五个不同产地绞股蓝茶挥发物及香气成分研究

王忠泽，杨宇涵，张红霞，杜芝芝*

1中国科学院昆明植物研究所资源植物与生物技术重点实验室 云南省野生资源植物研发重点实验室，昆明 650223；2中国科学院大学，北京 100049

绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino)，属于葫芦科(Cucurbitaceae )绞股蓝属(Gynostemma)，是一种多年生草质攀援植物，广泛分布于中国陕西南部和长江以南各省，在朝鲜、日本以及一些东南亚国家也有分布[1]。在中国，绞股蓝已经具有几百年的食用历史，作为蔬菜始记载于明朝(公元1368～1644年)出版的《救荒本草》一书中[2]。此外，长期以来绞股蓝还作为一种草药被用于中国民间医药中，具有清热解毒、止咳祛痰的功效。现代大量研究表明，绞股蓝具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、免疫调节和抗动脉粥样硬化[3]等多种药理活性。绞股蓝作为一种药食同源植物，也常被制作为绞股蓝茶冲泡饮用。不同的挥发性成分以一定的比例和含量组成混合物,进而呈现出不同的茶风味。香气是茶的灵魂,关乎茶品质的优劣[4]。关于绞股蓝茶挥发性成分的研究已有相关文献报道，但使用溶剂辅助风味蒸发(SAFE)方法对其挥发性成分进行提取却未见报道。目前，SAFE在茶挥发性成分萃取中受到越来越多的重视，低真空度及低冷凝温度控制能够获得自然、真实的茶汤香气，且蒸馏过程中可除去不挥发性物质[4]。

为了了解不同地区产绞股蓝茶在挥发性成分方面是否存在差异，本研究采用SAFE对5个不同产地绞股蓝茶的挥发性成分进行提取，利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对其挥发性成分进行分析，通过NIST.17质谱库检索并运用峰面积归一法确定各个组分的相对含量，结合文献报道对绞股蓝茶挥发性成分的香气特征进行了详细梳理和总结，从而为进一步研究绞股蓝茶风味及资源的开发利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

湖南张家界、安徽毫州、广西金秀三个样品均为市售绞股蓝茶，分别购自湖南张家界爱尚园茶业有限公司、安徽亳州市茗芳百花茶叶商贸有限公司和广西金秀圣塘山天然保健品有限公司；陕西平利样品购于四川荷花池中药材市场，产地陕西平利；云南玉溪样品采自云南玉溪，样品经中国科学院昆明植物研究所陈文允副研究员鉴定，收割后切成3～5 cm小段洗净晾干。

表1 样品来源及名称Table 1 Sample source and name

1.2 试剂与仪器

二氯甲烷(色谱纯,美国Meridian Medical Technologies)；C7～C30的正构烷烃(色谱纯，美国SUPELCO公司)；溶剂辅助风味蒸发装置(英国Edwards公司真空泵)；7890A-5795C型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；HP-5色谱柱(50.0 m×0.32 mm×0.5 μm，美国安捷伦公司)；DB-wax色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦公司)。

1.3 提取方法

准确称取绞股蓝茶25 g，加入沸腾的蒸馏水500 mL密闭浸泡5 min后过滤，再用冰水迅速冷却滤液。随后向滤液中加入150 mL二氯甲烷，超声30 min，再以5 000 rpm的转速离心15 min，将上清液部分倒入分液漏斗进行分液，收集二氯甲烷相，以上步骤重复3次。合并二氯甲烷相，在35 ℃恒温水浴条件下用旋转蒸发仪浓缩至200 mL左右，加入过量无水硫酸钠，过滤得到萃取液。将该萃取液置于溶剂辅助风味蒸发装置(SAFE)的滴液漏斗中，并在冷阱中加入液氮，将循环水和水浴的水温分别设为40 ℃和45 ℃，当系统真空度达到1×10-4MPa时，缓慢打开滴液漏斗活塞，萃取过程中保持样品匀速滴下，以制取挥发性物质萃取液。随后在35 ℃恒温水浴条件下使用旋转蒸发仪将挥发性物质萃取液浓缩至1 mL，于-4 ℃保存，各个样品均无重复。

1.4 GC-MS分析条件

质谱条件：离子源：EI源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量：70 eV，质核比扫描范围：40～500m/z。

HP-5色谱柱，程序升温条件为初始温度50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min，分析检测时间共67.667 min；进样量1 μL，不分流，载气为高纯He(99.99%)；载气流量1.2 mL/min；溶剂延迟10 min。

DB-wax色谱柱，程序升温条件为初始温度50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至100 ℃，保持0 min，以2 ℃/min升至220 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min，分析检测时间共86 min;进样量1 μL，不分流，载气为高纯He(99.99%)；载气流量1 mL/min；溶剂延迟5 min。

1.5 挥发性成分鉴定

采用质谱比对(MS)和保留指数比对(RI)相结合的方法对所分离的挥发性化合物进行鉴定。将GC-MS分析所得到的质谱谱图与NIST14质谱谱库进行比对；通过C7～C30正构烷烃GC-MS数据计算样品总离子流图中所积分的色谱峰的保留指数，与NIST Chemistry WebBook(http：//webbook.nist.gov/chemistry/)在线数据库进行比对。

2 结果与分析

2.1 五个不同产地绞股蓝挥发性成分分析鉴定

采用SAFE提取结合GC-MS分析对绞股蓝茶中的挥发性化合物进行了鉴定，得到五个不同产地绞股蓝茶样品的挥发性成分总离子流图(检测用非极性色谱柱HP-5和极性色谱柱DB-wax)见图1和图2，为了鉴定结果的可靠性，只保留了两种柱子同时检测到的且与数据库匹配度高的化合物。

图1 五个不同产地绞股蓝茶的挥发性成分总离子流图(非极性色谱柱HP-5)Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components of five different origins of G.pentaphyllum tea (non-polar chromatography column HP-5)

图2 五个不同产地绞股蓝茶的挥发性成分总离子流图(极性色谱柱DB-wax)Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile components of five different origins of G.pentaphyllum tea (polar chromatography column DB-wax)

五个绞股蓝茶样品总共鉴定到98个化合物，如表2所示，这些化合物分别属于9个化学类别，包括醛类、酸类、酚类、酯类、腈类、杂环化合物、酮类、醇类和烃类及其衍生物。

表2 五个不同产地绞股蓝茶挥发性成分的保留指数和相对百分含量 Table 2 Retention index and relative percentage of volatile components in G.pentaphyllum tea from five different regions

续表2 (Continued Tab.2)

续表2 (Continued Tab.2)

续表2 (Continued Tab.2)

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从图3可以看出，各个样品化合物类别大致相同，而各类别化合物数量存在一定差异。安徽样品包含6个化学类别，其中烃类及其衍生物挥发性化合物种类最多，为16种。除安徽样品外，其余样品含酯类成分最多。湖南样品为所含挥发性类型最丰富，包含了以上9个化学类别，其中苯乙腈在其它四个样品都未检测到。

图3 五个不同产地绞股蓝茶的挥发性成分类别及各类别数量Fig.3 The five different origins of G.pentaphyllum tea volatile component categories and the number of each category

从广西、安徽、湖南、陕西和云南样品中分别鉴定得到48、49、50、51和50个化合物。五个不同产地绞股蓝有15个共有成分(表2)，分别为苯甲醛、正辛醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、苯甲醇、苯乙醛、罗勒烯、香兰素、二氢猕猴桃内酯、月桂酸乙酯、2，4-二羟基-2，6，6-三甲基环己基乙酸γ-内酯、植酮、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸乙酯、十八酸乙酯。这些共有成分包括5个醛类、7个酯类、1个烃类、1个醇类、1个酮类。

采用峰面积归一化法计算各挥发性成分的相对百分含量，结果见表2。在五个样品中酯类相对百分含量占比均最大，但在安徽、广西样品中，酯类相对百分含量第一，其次为烃类及其衍生物，而在湖南、陕西和云南样品中，酯类相对百分含量最高，醛类第二。从表2可知五个样品两种色谱柱检测结果基本一致，五个样品二氢猕猴桃内酯、棕榈酸乙酯含量均很高。在广西样品中，含量最高的化合物为二氢猕猴桃内酯，HP-5和DB-wax两种色谱柱相对百分含量分别为6.421%和15.124%；湖南样品二氢猕猴桃内酯含量最高，HP-5和DB-wax两种色谱柱相对百分含量分别为7.769%和7.467%；陕西样品二氢猕猴桃内酯含量也最高，HP-5和DB-wax两种色谱柱相对百分含量分别为7.624%和8.416%；而在安徽样品棕榈酸乙酯含量最高，HP-5和DB-wax两种色谱柱相对百分含量分别为12.471%和12.961%，云南样品棕榈酸乙酯含量最高，HP-5和DB-wax两种色谱柱相对百分含量分别为7.096%和11.601%。除以上两种主要挥发性成分外，广西样品主要成分还包括2，4-二羟基-2，6，6-三甲基环己基乙酸γ-内酯；安徽主要成分还包括四氯乙烷、5-羟甲基糠醛、咖啡因、反油酸乙酯、2，4-二羟基-2，6，6-三甲基环己基乙酸γ-内酯；湖南样品主要成分还包括四氯乙烷、(E，E)-2，4-庚二烯醛、香兰素、苯乙醇、月桂酸乙酯和2，3-二氢苯并呋喃、2，4-二羟基-2，6，6-三甲基环己基乙酸γ-内酯；陕西样品主要成分还包括月桂酸乙酯、香兰素、2，3-二氢苯并呋喃；云南样品还包括苯甲醇、香兰素、月桂酸乙酯和苯乙醇。

2.2 绞股蓝挥发性成分气味描述和气味阈值

表3为五个绞股蓝茶挥发性化合物的气味描述和香气阈值。通过查阅文献，共得到51个挥发物的气味描述，其中AH样品28个化合物，GX样品35个化合物，HN样品40个化合物，SX样品35个化合物，YN样品31个化合物。由此可见，HN样品气味组成更加丰富。在五个绞股蓝样品中，酯类化合物含量最高且种类丰富，其中二氢猕猴桃内酯和棕榈酸乙酯含量均很高。二氢猕猴桃内酯具有木香和麝香气味[11]，其香气阈值未见报道；而棕榈酸乙酯具有清香气息[14]，其在水中的香气阈值为2 mg/L。结合香气成分在水中的阈值和化合物相对含量，初步分析广西绞股蓝茶的主要香气成分为1-戊烯-3-醇、苯乙醛、4-[2，2，6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、二氢猕猴桃内酯；安徽绞股蓝茶的主要香气成分为(E，E)-2，4-庚二烯醛、(+)-柠檬烯、苯乙醛、苯乙醇、二氢猕猴桃内酯；湖南绞股蓝茶的主要香气成分为(E，E)-2，4-庚二烯醛、香兰素、二氢猕猴桃内酯；陕西绞股蓝茶的主要香气成分为香兰素、2，3-二氢苯并呋喃、二氢猕猴桃内酯；云南绞股蓝茶的主要香气成分可能为香兰素、苯乙醇、二氢猕猴桃内酯。五个不同产地绞股蓝茶存在相同的主要香气成分，也有各自独特的成分，导致不同产地绞股蓝茶的气味存在差异。根据文献报导的化合物气味描述，绞股蓝茶样品中挥发物的特征包括“水果”、“花”、“青叶”、“木香”和“脂肪”的气味，使绞股蓝茶呈现出清香气味。

表3 五个不同产地绞股蓝茶挥发性成分的气味描述和香气阈值Table 3 Odor description and odor threshold of volatile components of G.pentaphyllum tea from five different origins

续表3 (Continued Tab.3)

续表3 (Continued Tab.3)

3 讨论

本研究采用SAFE提取了五个不同产地绞股蓝茶的挥发性成分，通过GC-MS分析及香气结果表明五个样品最主要成分都为二氢猕猴桃内酯和棕榈酸乙酯，但是含量有所不同，表明不同产地绞股蓝茶挥发性成分存在一定差异。Blythe等[31]使用HS-SPME/GC-MS对美国密西西比州栽种的绞股蓝茶挥发性成分进行了分析，共检出29种挥发性成分，主要成分为安息香醛(15.3%)、桉叶油醇(8.7%)、甲基庚烯酮(7.8%)、(Z)-3-己烯醛(7.6%)和α-紫罗兰酮(6.3%)。而在本实验中，五个绞股蓝茶样品均检测到安息香醛，但含量远低于该文献报道。广西和湖南样品中检测到α-紫罗兰酮，广西、湖南和陕西样品中均检测到甲基庚烯酮，桉叶油醇和(Z)-3-己烯醛在五个样品都未检测到。与已报道文献相比较，绞股蓝茶挥发性成分存在差异性，可能存在以下几个因素：一是提取方法不同；二是由于挥发性成分对遗传和环境因素，包括气候，土壤状况，该植物品种和生长地点都很敏感，以上条件不同导致五个不同产地绞股蓝挥发性成分存在差异。

在鉴定出的大量挥发物中，能影响食物整体香气的挥发物很少，香气成分的种类及含量决定着绞股蓝茶的质量。在五个绞股蓝茶样品中，酯类化合物含量最高且种类丰富，推测酯类对绞股蓝茶香气有一定贡献。据文献报道，苯甲醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、苯乙醛、二氢猕猴桃内酯是茶的关键香气化合物[32]，而在绞股蓝茶五个样品中，以上四种化合物均可检测到。二氢猕猴桃内酯是茶叶高质量风味的关键香料之一，因其在五个不同地区绞股蓝中含量很高，所以推测其对绞股蓝香气可能具有重要贡献，为绞股蓝茶的关键香气成分之一，该化合物在食品工业和卷烟工业中有着重要的应用价值。结合五个不同产地绞股蓝茶中化合物的相对含量和阈值，可知五个不同产地绞股蓝茶都具有与真正茶相同的关键香气成分，还具有它本身特有的香气特征成分。

4 结论

本实验对云南玉溪、安徽毫州、湖南张家界、广西金秀和陕西平利五个不同产地绞股蓝茶的挥发性成分进行了鉴定，结果表明不同来源的绞股蓝茶风味不尽相同。二氢猕猴桃内酯为五种不同产地绞股蓝茶中共有关键成分，为绞股蓝茶贡献了木香气味。此外，不同产地绞股蓝茶还具有其独特的特征成分。1-戊烯-3-醇、苯乙醛、4-[2，2，6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮为广西绞股蓝茶贡献了青叶香、花香、和木香；(E，E)-2，4-庚二烯醛，(+)-柠檬烯，苯乙醛，苯乙醇为安徽绞股蓝茶贡献了脂肪油腻气息、柑橘味、花香；(E，E)-2，4-庚二烯醛，香兰素为安徽绞股蓝茶贡献了脂肪油腻气息、香草味；香兰素、2，3-二氢苯并呋喃为陕西绞股蓝茶贡献了香草味和花香；香兰素、苯乙醇为云南绞股蓝茶贡献了香草味和花香。绞股蓝茶作为茶饮风味俱佳，且有多种保健功效，预示绞股蓝具有很好的生产应用价值和市场开发前景。因此，本研究为绞股蓝茶风味物质的深入研究奠定了基础，也为绞股蓝茶的开发利用提供了理论依据。