灯盏花素及灯盏乙素对肝细胞色素P450 酶体内代谢的影响*

李天英，石 迪，郑 岩，郑春宇，李秋红

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）

细胞色素P450（cytochrome P450，简称CYP450）是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族，参与许多内源性和外源性物质的代谢[1]。人类有90%以上经肝脏代谢药物是由CYP450 催化的，其中3 种CYP450 同工酶（2%～4%by CYP2E1、10%by CYP2C9和40%～45%by CYP3A4）参与代谢近60%的药物[2]。抑制或诱导任何一种CYP450 同工酶都有可能引起不可预期的，甚至是严重的药物相互作用，尤其是通过同一种酶代谢的药物在临床联合应用时，极易引起不良反应[3]。

灯盏花素是从灯盏花中分离的黄酮类有效成分，研究表明其具有神经保护和抗凝血作用[4]。灯盏花素注射液是从中药灯盏花中提取的灯盏花素制成的无菌水溶液，主要用于治疗心脑血管方面的疾病，临床使用灯盏花素注射液时，联合用药可能是潜在的严重的危险因素[5]。灯盏乙素是灯盏花素的主要药效成分，主要用于心脑血管类疾病的治疗[6]。

目前，尚无灯盏花素注射液及灯盏乙素对CYP450 酶影响的系统研究。灯盏花素注射液及灯盏乙素对CYP450 酶的影响可能引起药物的相互作用，并潜在的限制了它们的使用。本实验中，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑分别是CYP2E1、CYP2C9 和CYP3A4 的探针底物，研究表明“Cocktail”探针药物法可以在同一时间内测定多种CYP450 酶的活性[7]。因此，在上述研究背景下，探讨灯盏花素注射液及灯盏乙素对大鼠体内CYP2E1、CYP2C9 和CYP3A4 的代谢活性影响，同时比较灯盏花素注射液及灯盏乙素对CYP450 各亚型作用过程中的关联性，具有重要意义。

1 材料与仪器

1.1 药品及主要试剂

灯盏花素注射液（批号：1011111032，石药银湖制药有限公司）；灯盏乙素（批号：27740018，大连美仑技术有限公司）；氯唑沙宗原料药（批号20110701，大连美仑生物技术有限公司）；甲苯磺丁脲原料药（批号20110501，大连美仑生物技术有限公司）；咪达唑仑注射液（批号20120302，江苏恩华药业股份有限公司）；色谱甲醇（迪马科技公司）。

1.2 实验仪器

LC-2010A 高效液相色谱仪（LC-10ATVP 泵，SPD-10AVP 检测器，Class-VP 色谱工作站，日本岛津）；TDL-60B 型低速台式离心机（上海荣泰生化工程有限公司，半径=13cm）；旋涡TQ-1 型混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；TGL16M 型高速冷冻离心机（北京众益中和生物技术有限公司，半径=5.5cm）；SK8200H 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.3 实验动物

清洁级Sprague-Dawley 大鼠（180-220g），雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。合格证号SCXK（黑）2008004。动物实验均通过伦理委员会批准同意。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：TopsilTM C18column（250mm×4.6mm,5μm, 上海月旭科技公司），流动相：甲醇：NH4H2PO4（pH 值为3.4）=54∶46，流速：l.0ml·min-1，检测波长：230nm，柱温：30℃。

2.2 生物样品采集

将18 只SD 大鼠随机分为3 组，即对照组、灯盏花素注射液组及灯盏乙素溶液剂组。对照组大鼠每日于尾静脉注射生理盐水，每天一次，连续7d；灯盏花素注射液组大鼠每天于尾静脉注射给予灯盏花素注射液5mL·kg-1，每天一次，连续7d；灯盏乙素组大鼠每天于尾静脉注射灯盏乙素溶液剂30mg·kg-1，每天一次，连续7d；第8d 各组均于尾静脉缓慢注射Cocktail 探针药物溶液，剂量分别为甲苯磺丁脲2.5mg·kg-1、氯唑沙宗和咪达唑仑各5mg·kg-1。分别于注射氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的混合溶液前和给药后5、10、15、20、30min 和1、2、4、8、12、24h 眼内毗静脉取血0.8mL 至肝素化离心管中，3500r·min－1离心10min，分离血浆，血浆样品在-20℃冷冻保存待分析。

2.3 生物样品处理

精密移取大鼠血浆样本200μL，加入内标溶液20μL（4μg·mL-1的地西泮），摇匀，加入氯仿2.0mL，涡旋5min，3500r·min－1离心10min，取下层有机相1.8mL 于另一试管中，40℃N2吹干，200μL 流动相复溶，20μL 进样。

2.4 数据分析

采用中国药理学会数学药理专业委员会编制的药代动力学软件程序DAS2.0 非房室模型，求出每只大鼠体内氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的药代动力学参数，结果以“均值±标准差”（x±s）表示，采用单因素方差分析进行组间比较，Dunnett's 检验进行两两比较。P＜0.05 表示有显著性差异。

2.5 灯盏花素注射液和灯盏乙素对大鼠体内CYP2E1 的影响

各组氯唑沙宗的药动学参数及药时曲线见表1和图1。

表1 对照组、灯盏花素组和灯盏乙素组中氯唑沙宗的药动学参数（n=6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of chlorzoxazone after administration of chlorzoxazone（5mg·kg-1）in control,breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

图1 对照组、灯盏花素组和灯盏乙素组中氯唑沙宗的平均血药浓度-时间曲线（n=6）Fig.1 Mean plasma concentration-time of chlorzoxazone in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

灯盏花素注射液组及灯盏乙素组分别与对照组比较，氯唑沙宗的药动学参数没有统计学差异；灯盏花素注射液组的氯唑沙宗与灯盏乙素组比较，药动学参数没有显著性差异。结果表明灯盏花素注射液及灯盏乙素对大鼠体内CYP2E1 没有影响。

2.6 灯盏花素注射液和灯盏乙素对大鼠体内CYP2C9 的影响

各组甲苯磺丁脲的药动学参数及药时曲线见表2 和图2。

表2 对照组、灯盏花素组和灯盏乙素组中甲苯磺丁脲的药动学参数（n=6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters of tolbutamide after administration of tolbutamide（2.5mg·kg-1）in control,breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

图2 对照组、灯盏花素组和灯盏乙素组中甲苯磺丁脲的平均血药浓度-时间曲线（n=6）Fig.2 Mean plasma concentration-time of tolbutamide in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

灯盏乙素组的甲苯磺丁脲与对照组比较，AUC(0-t)，AUC(0-∞)，t1/2分别增加了34.2%，43.4%和56.8%（p＜0.05），CL 减小了57.89%（p＜0.05）；而灯盏花素注射液组的甲苯磺丁脲与灯盏乙素组比，AUC(0-t)，AUC(0-∞)，MRT(0-∞)，t1/2分别增加了48.9%，52.7%，39.8%和65.6%（p＜0.05），CL 减小了52.9%（p＜0.05）。灯盏花素注射液组的甲苯磺丁脲与对照组相比，药动学参数没有统计学差异。结果表明灯盏乙素对大鼠体内CYP2C9有潜在的抑制作用，但是灯盏花素注射液对大鼠体内CYP2C9 的活性没有影响。

2.7 灯盏花素注射液和灯盏乙素对大鼠体内CYP3A4 的影响

各组咪达唑仑的药动学参数及药时曲线见表3和图3。

表3 对照组、灯盏花素组和灯盏乙素组中咪达唑仑的药动学参数（n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters ofmidazolamafter administration of midazolam（5mg·kg-1）in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

图3 对照组、灯盏花素组和灯盏乙素组中咪达唑仑的平均血药浓度-时间曲线（n=6）Fig.3 Mean plasma concentration-time of midazolam in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

灯盏花素注射液组及灯盏乙素组的咪达唑仑分别与对照组比较，AUC(0-t)增加了76.9% 和65.4%（p＜0.05），AUC(0-∞)增加了78.6% 和76.6%（p＜0.05），t1/2增加了77.2% 和57.5%（p＜0.05），而且MRT 显著延长，CL 急剧减慢（p＜0.05）；灯盏花素注射液组的咪达唑仑与灯盏乙素组比较，药动学参数没有显著性差异。结果表明，灯盏花素注射液组和灯盏乙素组的咪达唑仑代谢显著减慢，因此，灯盏花素注射液和灯盏乙素均对大鼠体内CYP3A4 有显著的抑制作用。

3 结论

灯盏花素注射液不是纯的化学物质，而是包含至少9 个化合物的混合物。据报道[8]，这9 个化合物分别是灯盏乙素、黄芩苷、柚皮素、东莨菪素、山奈酚、芹菜素、木犀草素、咖啡酸和原儿茶酸，其中灯盏乙素的含量占80%以上，是主要有效成分。从植物中分离一种化合物，通常情况下，药理作用会随着化合物纯度的增加而降低，所以其它化合物可能与主要活性成分起协同作用[9]。在本实验中，情况正好相反，灯盏乙素对CYP2C9 的作用明显高于灯盏花素注射液（p＜0.05），唯一可能的解释是灯盏花素注射液中其它那8 种成分与灯盏乙素对CYP2C9 产生的作用相反。

据报道，灯盏花素注射液在大鼠体外肝微粒体中对CYP2E1 和CYP2C9 的活性没有影响[10]，这一结果与本课题实验结果相同，表明灯盏花素注射液与通过CYP2E1 和CYP2C9 代谢的药物联用时，不会引起药物之间的相互作用。本研究中，灯盏花素注射液对CYP3A4 有抑制作用，而灯盏乙素是CYP2C9和CYP3A4 抑制剂，但是灯盏乙素对CYP2E1 的活性没有影响。另外，灯盏花素注射液组与灯盏乙素组对CYP450 酶活性进行比较，结果表明灯盏花素注射液与灯盏乙素对CYP2E1 和CYP3A4 活性的影响没有显著不同，说明灯盏乙素可能是灯盏花素注射液中对CYP2E1 和CYP3A4 产生作用的活性成分。本实验结果表明，灯盏花素注射液对大鼠体内CYP3A4 有抑制作用，对CYP2E1 和CYP2C9 没有影响；而灯盏乙素对CYP2C9 和CYP3A4 有潜在的抑制作用，但对CYP2E1 没有影响。以上结果可为临床上避免出现药物相互作用提供实验依据。