线粒体自噬及功能障碍与帕金森病

甘 雪刘书一王正波*

(1.昆明理工大学灵长类转化医学研究院,昆明 650500; 2.云南省中科灵长类生物医学重点实验室,昆明 650500)

线粒体自噬通常是在氧化应激、营养物质缺乏、细胞衰老或损伤的情况下,细胞为抵御外界刺激而产生的一种自我保护性行为;具体过程是当外界环境发生剧烈改变时,细胞内线粒体发生去极化损伤后,便会招募自噬小体,特异性的被包裹进入溶酶体中最终清除受损线粒体。线粒体自噬在维持线粒体的稳定以及质量控制中具有重要作用。通过对线粒体自噬深入研究发现,线粒体自噬的异常与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病和血液病等疾病的发生均具有紧密联系。

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)主要是由于黑质多巴胺能神经元进行性丢失及胞质内a-突触核蛋白(a-synuclein,a-syn)聚集成路易小体为表征的神经退行性疾病,是当前第二大神经退行性疾病。在PD 患者细胞中可以观察到线粒体自噬的相关基因PRKN,PINK1,DJ-1 表达[1]。在 PD 动物模型中存在大量水肿的线粒体[2],这些肿胀可能是由于a-突触核蛋白错误折叠、聚集引起的,并最终导致多巴胺能神经元死亡[3]。此外,在PD 患者脑组织和肌肉组织中的线粒体电子传递链复合物Ⅰ减少导致氧自由基的产生,以及线粒体氧化应激损伤[4],线粒体自噬及功能障碍与帕金森病的发病及进展也密切相关。

1 线粒体自噬及分类

线粒体是双层膜结构的细胞器,其结构封闭,通过呼吸氧化链、脂肪酸氧化与三羧酸循环的氧化磷酸化持续供给ATP 并维持细胞的基本代谢。在线粒体生理代谢活动过程中ROS 的积累会引发线粒体的损伤,改变线粒体膜通透性,引起线粒体内细胞色素 C 的释放并最终通过级联反应活化Caspase 凋亡蛋白进而引起细胞凋亡。生理状态下,细胞通过自噬途径选择性的降解受损线粒体来维持其稳态。一旦线粒体自噬功能受损后,老化的线粒体会在细胞中积累,从而引发细胞变性甚至死亡。根据细胞生物学的方法通常将线粒体自噬分为三种类型:第一种类型是在营养缺乏的条件下,前自噬结构形成杯状的吞噬泡,在磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)作用下,将单个线粒体包围隔离,随后,线粒体的外层酸化并发生去极化反应,最终在溶酶体中进行水解消化。第二种类型是受损线粒体的外膜与包含LC-3 连接蛋白的自噬体结合,发生线粒体去极化,囊泡被酸化降解。第三种类型线粒体自噬,也被称为微线粒体自噬,与线粒体衍生囊泡(mitochondria-derived vesicles,MDVs)形成有关,被氧化的线粒体蛋白通过出芽的方式形成线粒体衍生囊泡,囊泡逐渐融合成多泡体,最后被溶酶体水解形成线粒体碎片。正常生理机能状态下,线粒体通过自噬选择性清除受损伤或不必需的线粒体以维持稳态。病理状态下,线粒体自噬出现异常,与神经退行性疾病,糖尿病和肿瘤的发生有着密切关系。

线粒体自噬的关键步骤是待降解的线粒体和自噬泡之间的特异性识别,该过程是通过位于线粒体上的降解信号和自噬泡上的受体相互作用来介导的。线粒体自噬相关蛋白 Atg、Uth1、Aup1、NIX、PINK1 和 Parkin 等参与线粒体自噬过程,其中PINK1 和Parkin 与PD 发生相关,说明线粒体自噬与PD 疾病的形成密切相关。线粒体自噬通常可分Parkin 依赖型和Parkin 非依赖型[5],两种不同类型的自噬途径共同维持线粒体的稳态。

在Parkin 依赖型线粒体自噬中,在去极化或受到损伤的线粒体中,PINK1 会在线粒体外膜大量积累,聚集的PINK1 作为传感器招募Parkin 定位至线粒体并使其磷酸化成为活性形式,磷酸化的Parkin作为放大器使线粒体上的底物泛素化并形成多聚泛素化链,多聚泛素化链招募自噬受体OPTN 和NDP52[6],自噬受体与连接蛋白LC3 相互作用,随后存在于LC3 上的自噬泡作用域招募自噬泡启动线粒体自噬过程[7]。而Parkin 非依赖型线粒体自噬又分为受体介导自噬和泛素连接酶介导自噬两种类型。在受体介导自噬过程中,几种受体蛋白比如NIX、BNIP3、FUNDC1,其 C-末端位于线粒体外膜,N-端具有LC3 相互作用结构域(LIR),从而招募自噬小体诱导线粒体自噬过程[8]。自噬受体和Bclin1 调节因子1(AMBRA1)作为自噬的上游调节因子通过LIR 与LC3 相互作用引发线粒体自噬,其中AMBRA1 既能诱发Parkin 依赖型自噬又能介导非依赖型自噬[9]。在泛素介导线粒体自噬过程中,定位于线粒体外膜的 PINK1 招募 E3 连接酶(ARIH1)和突触核蛋白相互作用蛋白(Synphilin-1),促使线粒体外膜底物的磷酸化和多聚泛素化的形成进而招募 LC3 和自噬泡从而引发线粒体自噬[10]。

2 线粒体自噬与帕金森病

PD 致病因素至今不明,不仅包括遗传因素(基因易感性),同时也受环境、种族、年龄和性别等多种因素的影响,其中基因和环境的相互作用被认为是造成特发性PD 的根本原因。PD 分为家族型和散发型两种,分别占10%～15%和85%～90%[11],其中家族型PD 有常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传两种,家族性PD 患者通常表现为线粒体缺陷和自噬受损[12]。

2.1 环境毒素影响线粒体自噬及其功能

在环境这一致病因素中,人体长期暴露于铁、铜、锰、铅和汞等重金属时,将造成神经元的损伤而提高PD 的致病风险。例如,大量Fe2+在大脑中积累并发生Fenton 反应产生过多的羟自由基而导致神经元线粒体发生氧化应激,造成线粒体DNA 损伤以及抑制呼吸链作用,最终导致神经元的死亡[13]。同时,农药比如鱼藤酮、1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)和杀虫剂等主要破坏多巴胺能神经元,造成PD 风险的增高,其中鱼藤酮通过抑制线粒体呼吸链中复合物Ⅰ的活性而阻碍线粒体的氧化供能作用,而MPTP 则是通过损伤线粒体膜电位来影响线粒体正常生理功能,最终导致神经元的死亡。

2.2 PD 相关基因突变影响线粒体自噬及功能的机制

到目前为止,通过全基因组关联分析发现大约有92 个基因座与遗传性PD 相关[14],总共约有二十几个PD 易感基因,而在这些相关基因中对PD 影响较大的基因比如SNCA、PRKN等大多参与线粒体的自噬和功能调控过程,并且在这些基因突变的遗传性PD 患者中存在线粒体自噬通路的损伤和线粒体功能缺陷现象。因此PD 相关基因的突变将会造成线粒体的功能障碍最终导致PD 的病理现象。下文将会对部分的PD 相关基因(表1)的突变与线粒体自噬及其功能障碍的关系做一简要介绍。

2.2.1SNCA

SNCA基因位于4 号染色体的长臂端,对应于PARK1 和 PARK4 基因座,编码 a-syn 蛋白,其突变、重复或三联体均会导致常染色体显性PD[15];SNCA基因主要有以下三种点突变形式:A53T、A30P、E46 K。a-syn 由带正电荷的N-端、高度聚集倾向的疏水中心区域(NAC)、高酸性的C-端三部分组成,其中N-末端的前15 个氨基酸主要参与线粒体膜锚定以及扰乱膜疏水区域,而第16-30 个氨基酸残基能与磷脂的极性基团相互反应,说明N-末端主要负责与线粒体膜结合;NAC 负责蛋白的寡聚;而C-末端具有类似伴侣蛋白活性[16]。正是由于a-syn 具有线粒体亲和能力,才能使其定位至线粒体外膜并产生相应的生物学效应,比如影响线粒体蛋白的导入、抑制呼吸链内复合物Ⅰ的活性、影响线粒体动力学以及线粒体自噬过程等。

突变的a-syn 通过其N-末端定位于线粒体,并造成线粒体损伤使其功能紊乱,在影响线粒体自噬方面尤为突出[17-18],a-syn 主要通过以下几种方式来影响线粒体自噬功能:(1)a-Syn 通过N-末端与Miro 相互作用,且上调Miro 水平,导致过量的Miro聚集于线粒体表面,延迟线粒体自噬过程[19]。(2)A53T-a-Syn 过表达激活 P38 MAPK,使 Parkin 131位的丝氨酸磷酸化,破坏其生理功能,干扰线粒体自噬[20]。(3)A53T、E46K-a-Syn 在线粒体膜上过度积累导致心磷脂暴露于线粒体外膜,从而募集LC3连接蛋白,诱导线粒体自噬[21]。在正常细胞中线粒体外膜受体TOM 负责将核编码的线粒体蛋白运输入线粒体基质中,然而在PD 患者死后脑组织或PD动物模型中发现a-syn 定位至线粒体外膜并与TOM结合而阻断了线粒体相关蛋白的转运途径,导致线粒体所需蛋白不能被正常的运输至基质中,从而造成线粒体的功能损伤[22]。随后Reeve 等[23]人提出突变型a-syn 可能与外化的心磷脂相互作用而抑制呼吸链中复合物Ⅰ的活性,而复合物Ⅰ活性的下降通过级联反应使磷酸乙酰辅酶1(ACC1)磷酸化失去酶活性,磷酸化的ACC1 抑制线粒体脂质代谢过程进而影响生物合成,造成线粒体结构的损伤甚至断裂[24]。之前对具有毒性的a-syn 类型尚不清楚,但在Grassi 等[25]人研究中指出由a-syn 不完全降解形成的截短型a-syn 与磷酸化的ACC1 存在共定位关系,并且证明此种形式的a-syn 具有线粒体毒性,使膜去极化、诱导细胞色素C 释放等效应。以上研究多数基于在细胞中或动物模型上过表达突变型asyn 探讨其对线粒体自噬及功能障碍的影响。a-syn是路易小体的主要组成成分,同时还含有非蛋白物质(如脂质)[26]、膜性细胞器[27](如线粒体、溶酶体等)。最近研究者利用由a-突触核蛋白纤维(a-syn PFF)处理的神经元研究a-syn PFF 的聚集,追踪路易小体的形成过程,动态监测多种蛋白的变化情况。发现路易小体的形成会对线粒体的生理功能造成严重的影响,在不溶性包涵体中不仅富集了线粒体转运蛋白,同时与线粒体动力学、线粒体凋亡途径和能量代谢途径(三羧酸循环、NADH 代谢等)相关的蛋白质也得到了富集[28];说明a-syn 聚集形成路易小体导致线粒体功能障碍可能是造成帕金森病的重要原因。

表1 部分PD 易感基因相关信息Table 1 A part of PD susceptibility gene related information

2.2.2PRKN

PRKN基因大小为1.3 Mb,定位于6 号染色体上,该基因的突变会增加散发性、早发性PD 的风险。PRKN编码蛋白 Parkin 由465 个氨基酸组成,在其氨基酸序列中的第65 位丝氨酸残基处具有泛素样结构,即N-末端泛素样结构域(UBL),该残基能被PINK1 磷酸化形成具有活性的开放结构。但是在 UBL 结构域中氨基酸发生替换时会影响Parkin 的活性,比如 G12R、R33Q 和 R42P 形式的突变会抑制 PINK1 对 Parkin 的磷酸化作用;而 T55I突变形式促进Parkin 自身泛素化,从而导致Parkin蛋白的降解,这两种具有不同作用的氨基酸替换都会抑制线粒体的自噬活动[29-30]。过表达Parkin S65 N 的小鼠中Parkin 蛋白不能被磷酸化,并且出现选择性运动功能障碍,表明Parkin 蛋白第65 位氨基酸的磷酸化在PD 病理过程中具有重要地位。在中枢神经系统中相比于其他的神经元,多巴胺能神经元更易受到PINK1-Parkin 信号通路的影响,说明多巴胺能神经元对线粒体应激敏感[31-32]。同时对于增殖的细胞来说,定位于线粒体内膜的Parkin 能与线粒体DNA(mtDNA)和线粒体转录因子A(TFAM)相互作用,从而控制线粒体的代谢和功能性活动[33]。因此,Parkin 除了在线粒体自噬通路中有重要作用外,同时也能调节mtDNA 的复制、转录和翻译过程。

2.2.3PINK1

PINK1 基因定位于1 号染色体,其突变导致常染色体隐性遗传PD,其突变形式有L347P、G411S、Q456X 和 I368N 等。PINK1 基因编码蛋白为含有581 个氨基酸的PTEN 诱导激酶,该蛋白含有线粒体定位结构域和蛋白激酶结构域两个核心结构[34]。PINK1 蛋白定位于线粒体外膜,在健康的线粒体中,当其转移至线粒体内膜时受到早老素相关菱形样蛋白(PARL)的切割失去其激酶活性,随后N-末端被降解,不会导致线粒体的异常自噬。在损伤或去极化线粒体中,通过PINK1/Parkin 依赖性自噬通路清除受损的线粒体,防止由于受损线粒体过度积累而导致神经细胞的死亡。然而当PINK1 发生突变时,其激酶活性、自身磷酸泛素化、与底物的结合效率以及维持蛋白稳定性的能力均会发生变化,从而使线粒体发生功能障碍;在线粒体自噬方面表现得尤为突出,受损线粒体得不到有效清除,从而导致多巴胺能神经元的死亡,最终造成PD 形成[35]。

2.2.4LRRK2

LRRK2 基因位于16 号染色体短臂端,其错义突变常导致常染色体显性遗传PD[36]。LRRK2 蛋白主要由四部分组成,分别为N-末端的类锚定蛋白、富含亮氨酸的LRR 结构域、催化结构域和C-末端的WD40 结构域。LRRK2 蛋白的催化结构域中易发生突变,在2010 年所发现的外显子突变体有121种[37],其中 R1441C/G/H、Y1669C、G2019S、I2020T这6 种突变是常见类型,其中G2019S 是与疾病相关的最为常见的一种突变形式[38]。在LRRK2 G2019S 突变体中出现神经元营养不良现象并导致神经元死亡,同时发现P62 以及LC3 向线粒体趋化引起线粒体自噬水平上升。在A53T 转基因小鼠中,过表达LRRK2 促进a-syn 的聚集并增强其毒性作用,但是在LRRK2 敲除的小鼠中A53T-a-syn 的毒性作用会被阻断[39];同时在a/β/γ-syn 敲除鼠的原代神经元中,G2019S/Y1699CLRRK2 的表达所导致神经元的死亡显著的减少[40],说明LRRK2 与a-syn之间存在紧密的联系,可能通过相互作用的方式影响多巴胺能神经元的正常生理功能,但是具体通过何种机制而产生相互作用尚不清楚。

2.2.5DJ-1

DJ-1 基因位于1 号染色体的长臂端,该基因广泛表达于全身组织细胞,在脑内主要表达于黑质、皮层及杏仁核中[41]。DJ-1 基因突变是导致PD 常染色体隐性遗传的常见病因,已知突变类型有5 种,较为高发的是错义突变、同义突变和缺失突变。DJ-1 蛋白主要存在于细胞质中,因具有分子伴侣、蛋白酶活性所以在调节细胞多种功能中具有重要作用,比如抵抗细胞氧化应激、调节转录翻译和促进神经元分支形成等[42]。在多巴胺能神经元中,多巴胺对氧化应激敏感,而DJ-1 蛋白具有上调多巴胺合成限速酶即酪氨酸羟化酶的转录活性并通过氧化作用与多巴胺合成酶相互作用而促进多巴胺的合成,从而调节多巴胺的新陈代谢和动态平衡。同时DJ-1也是一种神经保护因子,当细胞发生氧化应激时,DJ-1 能定位至线粒体并成为氧化形式与PTEN 结合后负性调节由磷脂肌醇3 激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)介导的细胞凋亡过程,实现DJ-1 的细胞保护作用[42]。在亚细胞水平,DJ-1 还参与线粒体的自噬、形态以及 ATP 合成等调节过程[43]。最近 Maita等[44]人进一步解析了DJ-1 的突变影响线粒体合成ATP 和自噬的过程,具体机制如下:DJ-1 通过与线粒体ATP 合成酶的β 亚基结合,抑制线粒体解偶联过程,提高ATP 的合成效率;相反,在突变的DJ-1或在DJ-1 敲除的小鼠中线粒体解偶联增加,ATP的合成减少,造成线粒体的去极化,而去极化的线粒体招募自噬小泡促进线粒体的自噬过程,说明若DJ-1 突变发生在多巴胺能神经元细胞中,可以造成线粒体的过度自噬化导致神经元的供能不足,导致多巴胺能神经元的死亡。

2.2.6GBA

GBA基因位于1 号染色体短臂端,编码溶酶体酶β-葡萄糖脑苷脂酶(GCase),该酶具有将葡萄糖神经酰胺分解为神经酰胺和葡萄糖的作用。GBA点突变导致常见的溶酶体病-戈谢氏病(GD),其杂合突变形式N370S 和L444P 是导致常染色体显性遗传PD 最常见的遗传危险因素之一;相比于不携带突变的人群,发生GBA杂合突变人群更易形成早发性PD[45]。对成纤维细胞的内源性GCase 研究表明,相比于野生型GBA,N370S 和L444P 突变形式的GCase 其内在催化活性和合成水平降低 80% ～95%[46-47]。GBA突变引起的 GCase 表达量以及酶活性降低造成溶酶体功能障碍是导致PD 的主要原因之一,主要影响大自噬和伴侣介导自噬过程,导致聚集的a-syn 无法得到清除,最终影响神经元的正常生理活动;并且研究还发现GCase 和a-syn 存在正反馈现象。在Collin 等[48]人的小鼠十二指肠过表达a-syn 模型中发现GCase 表达量降低,随后在此模型中利用病毒载体将GBA基因递送至十二指肠,发现在60 天后a-syn 的含量显著减少,说明过量积累的a-syn 抑制GCase 表达从而加速自身聚集,形成PD 病理现象。

同时,GBA突变还会造成内质网应激、线粒体功能障碍和神经炎症等。在线粒体功能障碍方面,GBA突变影响线粒体蛋白导入机制、线粒体形态、线粒体融合与断裂和线粒体自噬功能,比如,在GBAL444P 转基因小鼠中,通过测量单个线粒体的长宽比发现,相较于野生型小鼠,其长宽比值增高,说明GBA突变延长了线粒体长度;同时在GBAL444P 模型小鼠海马区中发现线粒体分裂蛋白水平低,说明GBAL444P 使线粒体不能进行正常的裂变和融合[49];利用mt-Keima 荧光蛋白在一定波长下的荧光强度下表征线粒体向溶酶体转移情况的功能,在神经元中检测到线粒体自噬能力减弱现象,GBA突变不仅影响Parkin 依赖性自噬,还会抑制受体介导的线粒体自噬过程[50]。因此GBA突变不仅使a-syn得不到有效的清除同时还会造成神经元线粒体的功能障碍,最终造成神经元无法维持正常的生理功能。

3 小结和展望

帕金森疾病作为全球第二大神经退行性疾病,目前没有有效的治疗方式,关键问题还是PD 的具体发病机制尚不明确,但随着研究的不断深入,其致病因素正在被不断的发掘。PD 的致病因素众多,但是最终所导致的结果为黑质多巴胺能神经元的进行性丢失和死亡而出现PD 非运动症状和运动症状。a-syn 的异常聚集是PD 的关键病理特征,其编码基因SNCA 突变将会造成细胞的多项生理功能出现障碍,从而直接影响神经元的生命活动和代谢;同时 PD 相关基因PRKN、PINK1、DJ-1 等发生突变后也会影响线粒体自噬水平和正常生理功能,最终直接或间接的诱发PD 的发生和发展。尽管,目前有很多的PD 相关基因被发现并对其蛋白功能有一定的阐述,但是这也只是从某些方面揭示PD的发病机制。根据众多的研究,值得肯定的是线粒体自噬紊乱所引发的线粒体功能障碍是导致PD 发病的重要因素。因此,通过调节线粒体自噬水平使线粒体自噬维持在正常水平将成为治疗PD 的关键靶点和思路,但这一具有挑战性的治疗策略还需要对线粒体自噬与PD 之间的联系进行更加深入的研究。