柚皮素联合5-FU对大肠癌细胞增殖和迁移的影响*

周 跃，周燕红

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院五官医学院)

大肠癌 (colorectal cancer，CRC) 是一种高度侵袭性的人类恶性肿瘤，通常诊断时已为晚期[1]。据国际癌症研究机构(international agency for research on cancer) 2018年估计，CRC已成为第三大最常见的恶性肿瘤和第二大癌症死亡原因，全球每年约有180万新病例和90万人死亡[2]。目前，除手术外，CRC患者的治疗主要依靠化疗，尤其是晚期CRC患者。化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)一直是治疗CRC的一线方案[3]。由于5-FU对正常细胞有毒性，患者治疗时容易产生耐药性和严重的副作用，在晚期CRC中5-FU单药治疗的总有效率被限制在10%～15%[4]。因此，迫切需要改进以5-FU为基础的化疗方法治疗CRC。

国内外药理研究表明，柚皮素(NAR)是一种具有多种生物活性的柑橘类黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗病毒、神经保护、肾保护、免疫系统调节、促进碳水化合物代谢等多种生物活性，被认为是癌症的一种潜在治疗药物[5-6]。本实验采用体外培养人大肠癌LoVo细胞的方式，来探讨柚皮素与5-FU联用对大肠癌LoVo细胞增殖、迁移的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人大肠癌LoVo细胞购自中国科学院细胞库。柚皮素购自Sigma公司；5-FU购自MCE公司；RPMI-1640培养基购自Procell公司；青链霉素和胎牛血清购自Gibco公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自Beyotime 公司；Transwell小室购自Falcon公司。

1.2 细胞培养

将大肠癌LoVo细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640的完全培养基中，37℃、5%CO2的饱和湿度条件下培养，待细胞的密度达到80%时，按1∶3的比例对细胞进行传代。

1.3 CCK-8法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期，生长状态良好的细胞，用RPMI-1640完全培养基调整细胞密度到5×104/mL，接入96孔板，每孔100μL细胞悬液，同时设空白组，37℃、5%CO2培养24h(在细胞孔周围孔内加入100μL无菌PBS)。细胞贴壁后，弃去上清，分别加入柚皮素(0、100、200、400、600、800μmol/L)处理24、48、72h，5-FU(0、5、10、20、40、80、160、320μmol/L)处理48h，每组6个复孔，每孔加入20μL CCK-8试剂，置于37℃培养箱中4h。酶标仪450nm测定各孔吸光值OD。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率(inhibitory rate，IR)：IR%=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(正常对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 药物联合作用评价

将不同浓度的5-FU与柚皮素按1∶4固定比分别联合用药，柚皮素浓度为(2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)，5-FU浓度为(10、20、40、80、160、320 μmol/L)，CCK-8测定各组增殖抑制率。采用Chou-Talalay方法[7]，研究了柚皮素与5-FU之间的药物相互作用，并利用Compusyn软件计算了其联合指数(CI)的结果，其中CI<1为协同作用，CI=1为添加作用，CI>1为拮抗作用。使用Compusyn 1.0软件生成效应-联合指数曲线，即Fa-CI图，Fa为药物作用效应。

1.5 Transwell测定细胞迁移能力

将LoVo细胞分为4组：正常对照组、柚皮素组、5-FU组、柚皮素+5-FU组。①正常对照组：仅加含RPMI完全培养基；②柚皮素组：80μmol/L浓度的柚皮素作用；③5-FU组：20μmol/L浓度的5-FU；④柚皮素+5-FU组：80μmol/L柚皮素和20μmol/L的5-FU；各组的细胞作用时间为48h。将无血清RPMI-1640培养基重悬细胞，稀释细胞浓度至3×105/mL，备用；在24孔板中预先加入800μL 10% FBS 的RPMI-1640培养基(含双抗)，并放入Transwell小室，在上室分别接入200μL各组细胞悬液，37℃、5%CO2培养箱培养24h；取出Transwell小室，用PBS清洗，70%冰乙醇溶液固定细胞1h；用0.5%结晶紫染液染色，PBS清洗，用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，显微镜下观察拍照。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 柚皮素、5-FU单独用药对LoVo细胞增殖的影响

不同浓度柚皮素对LoVo细胞均有不同程度的抑制作用，并呈浓度-时间依赖性(P<0.05)，见图1。处理48h时后，与24h相比，柚皮素的细胞抑制显著增强(P<0.05)；处理72h时后，与48h相比，柚皮素细胞增殖抑制率无差异(P>0.05)，因此，后续实验确定48h为最佳的作用时间，见表1。5-FU 在48h的增殖抑制率也随着浓度显著上升，见图2。48h时，柚皮素的IC50为329.30μmol/L，5-FU的IC50为87.61μmol/L。

表1 柚皮素干预LoVo的细胞增殖抑制率

图1 柚皮素对LoVo细胞的增殖抑制作用(n=6)

与对照组比较，**P<0.01；与前一浓度组相比，#P<0.05,n=6

2.2 柚皮素联合5-FU的对LoVo细胞的增殖抑制作用

相对于单独使用柚皮素或者5-FU，联合用药显著增强LoVo细胞的增殖抑制率且各浓度下CI<1(见图3、图4)，结果提示柚皮素联合5-FU对LoVo细胞有协同抑制作用。5-FU (20μmol/L) + NAR(80μmol/L)的浓度组合，该浓度下柚皮素和5-FU联合用药组较单独用药组均有显著性差异(P<0.01)，且增殖抑制率接近联合用药的半数抑制率，提示这两种浓度的组合抑制 LoVo细胞增殖作用比较明显，并且具有较高协同效果(0.4≤CI<0.6)。见表2。

联合组与柚皮素组比较，##P<0.01；联合组与5-FU组比较，**P<0.01

图4 柚皮素联合5-FU对LoVo细胞的效应与联合指数曲线

表2 5-FU联合柚皮素对LoVo细胞体外增殖48h的联合用药指数CI

2.3 柚皮素联合5-FU对LoVo细胞的迁移作用

采用Transwell小室实验对LoVo细胞的细胞迁移能力进行了分析。对照组、柚皮素(80μmol/L)、5-FU(20μmol/L)、联合组分别作用细胞后，穿膜细胞数分别为(323.20±17.97)、(167.60±22.80)、(131.20±8.77)、(82.20±7.14)个。与正常对照组细胞相比，单纯使用5-FU或柚皮素治疗细胞迁移能力均下降(P<0.01)，而联合治疗的两个药物较单独用药有更显著的抑制细胞迁移能力(P<0.01)。见图5。

A.对照组 B.柚皮素组 C.5-FU组 D.柚皮素+5-FU组

3 讨 论

目前，大肠癌依旧是常见的恶性肿瘤，晚期患者死亡率高，25%的患者在诊断时已发生转移性疾病[8]。目前CRC的治疗以手术和化疗为主。5-FU是大肠癌的常用化疗药物，以5-FU为主的联合化疗也是结直肠癌治疗的常用方案，但是毒副作用与耐药性限制其治疗效果。众多研究已表明大肠癌可以通过早期诊断和联合化疗提高生存率。研究一些天然化合物发现它们可能对传统的细胞毒性治疗敏感，增强药物的有效浓度，加强两者的联合作用，或对肿瘤细胞产生特异性的细胞毒性作用，能降低抗肿瘤药物的耐药性，即使在高剂量下也可减轻其毒性作用[9]。中药配合化疗药物治疗大肠癌，不仅可以明显减轻化疗的副作用，提高患者耐药性和改善患者气血、增强疗效，而且作为一种新疗法，已逐渐进入结直肠癌的临床治疗中，在晚期患者的治疗中疗效显著。因此，寻找高效、低毒的天然药物降低化疗药物的毒性、增强其疗效，成为大肠癌治疗研究热点。

研究表明，柑橘类黄酮类化合物与化疗药物联合治疗对肿瘤细胞的生长也有很好的抑制效果，可以作为辅助化疗药物的来源[10]。柚皮素属柑橘类黄酮类化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤等特性，能抑制皮肤癌、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌等多种癌症，也具有化学预防、毒副作用小的性质，柚皮素也被认为是癌症的一种潜在辅助化疗药物，能协同增加化疗药的抗癌效果[5]。如柚皮素和他莫昔芬联合处理ER+型乳腺癌较单药处理有显著抗增殖、抑制细胞迁移及诱导细胞凋亡等作用[11]。柚皮素对前列腺癌细胞的增殖和迁移具有明显的抑制作用，与紫杉醇联用后对LNCaP前列腺癌细胞的生长有协同作用[12]。

在本实验中，我们评估了5-FU和天然化合物柚皮素联合使用对大肠癌细胞增殖和迁移的影响。结果发现两种化合物的组合给药方式，低剂量的5-FU，表现出良好的协同抗增殖作用，能有效抑制细胞的迁移能力，与已报道过的5-FU联合其他化合物的抗癌结果相似[13-15]。

综上所述，柚皮素联合5-FU可以有效抑制大肠癌增殖、迁移，但是其机制和体内实验效果仍需要深入进行探究。