高通量二代测序技术在耐药结核病诊断中的应用

辜吉秀 李晴 马玲 李银花 王冬冬 司红艳

耐药结核病的诊断长期依赖于表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，该试验方法用时比较长，从痰标本收集、培养至比例法药敏试验结果报告需要2.5个月[1]，不能满足耐药结核病及时精准诊断及治疗。近几年耐药结核病分子诊断已被广泛应用，下一代测序(next-generation sequencing，NGS)技术，即“二代测序技术”，该方法属于分子药敏试验，它采用高通量测序技术，在降低测序成本的同时，还提高了测序速度，并且保持了高准确性。随着NGS技术的广泛使用，探索NGS技术在结核病耐药性诊断中的应用有比较大的价值[2-3]。本研究搜集2016—2017年甘肃省结核病耐药基线调查的150株菌株，采用比例法及NGS技术进行药敏试验，以比例法药敏试验结果为参考标准，评价NGS技术对耐药结核病的检测效能。

材料和方法

一、材料收集

本研究搜集2016—2017年甘肃省结核病耐药基线调查获得的150株临床分离株，其中非结核分枝杆菌(NTM)2株，剔除NGS检测失败13株，最后纳入分析的结核分枝杆菌菌株为135株。

二、研究方法

1.药敏试验：使用比例法，培养基中药物的最终浓度异烟肼：0.2 μg/ml；利福平)：40 μg/ml； 乙胺丁醇：2 μg/ml；链霉素：4 μg/ml；氧氟沙星：2 μg/ml；药敏试验同时接种对硝基苯甲酸(PNB)、噻酚二羧酸肼(TCH)鉴别培养基，进行结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非结核分枝杆菌的初步鉴定。分枝杆菌培养、药敏试验及菌种鉴定培养管由珠海贝索生物技术有限公司生产。

2．DNA提取：150株菌株用改良的十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法进行DNA提取。使用10 μl一次性接种环挑取培养菌株2-环,加入0.5 ml三羟甲基氨基甲烷+乙二胺四乙酸(简称TE)缓冲液与1.5 ml EB(eppendorf)管中，密封95 ℃ 30 min灭活；离心半径8 cm ，12 000 r/min 离心5 min，弃上清后菌体沉淀以400 μl TE缓冲液重悬，加入50 μl溶菌酶混匀，37 ℃ 孵育20 h；加入70 μl 10%十二烷基硫酸钠(简称SDS)、5 μl蛋白酶K溶液，混匀，65 ℃孵育10 min；加入10 μl 5 mol NaCL和100 μl CTAB/NaCl溶液，漩涡振荡混匀、孵育；加入750 μl氯仿/异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，离心半径8 cm，12 000 r/min 离心5 min；吸取上清液至另一支新的离心管，加入450 μl异丙醇沉淀DNA，20 ℃ 孵育30 min；离心半径8 cm，12 000 r/min 离心15 min,弃上清，加入1 ml 70%乙醇，颠倒清洗DNA；离心弃上清，留20 μl；离心半径8 cm ，12 000 r/min 离心30 s后吸出剩余液体；室温干燥，用50 μl TE溶解沉淀，-20 ℃冷冻备用。

3．NGS技术检测：将150份DNA样本送至中国科学院微生物所，使用Illumina hiseq Xten测序仪进行PE150双端测序，按照500 ng起始量，以H37Rv(ATCC 27294)标准株作为耐药敏感株进行对照进行测序。测序的5种药物耐药相关基因见表1。

表1 五种药物采用NGS技术测序的相关耐药基因

4.结果分析：使用Excel工作表收集药敏试验结果；以H37Rv(ATCC 27294)标准株作为阴性对照菌，对常见的耐药相关位点inhA、katG、embB、ropB、rpsL、rrs、gyrA、gyrB进行测序，使用抗生素综合检索数据库(CARD)进行耐药比对分析。将菌株药敏试验结果和测序结果进行比对分析。并将二代测序原始阅读数据(raw reader)结果上传美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnotogy Infornation，NCBI)(SRP269873)。

三、统计学处理

以药敏试验作为参考标准，计算NGS技术对耐药结核病检测的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。使用SPPS 26.0软件进行两种方法的一致性Kappa检验(K<0.40 认为一致性较差；0.40≤K<0.75 认为一致性一般；K≥0.75认为一致性较好[4])。

结 果

一、NGS对5种药物耐药性检测的效能

以药敏试验结果作为参考标准，NGS检测135株菌株对异烟肼耐药的敏感度为88.75%(71/80)，特异度为100.00%(55/55)；NGS技术对各药品耐药性检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值见表2。

二、结核分枝杆菌对5种药物耐药的相关基因突变类型及频率分析(表3)

1.异烟肼：对异烟肼耐药相关基因katG、inhA和ahpC间隔区进行检测，71株发生突变，有8种突变类型，其中69株与katG315的突变有关，突变频率为97.18%(69/71)，katG315单独突变的是64株，联合katG315突变菌株5株。比例法药敏试验71株耐药菌株中有9株没有检测到突变，55株敏感菌株没有检测到突变。

2.乙胺丁醇：对乙胺丁醇耐药相关基因embB进行检测， 33株发生突变，有5种突变类型，其中27株与embB306位点的突变有关，突变频率为81.82%(27/33)，单独突变25株，联合embB306位点突变菌株2株。比例法药敏试验21株耐药菌株中有3株没有检测到突变，114株敏感菌株中有15株检测到突变。

3.利福平：对利福平耐药相关基因rpoB基因进行检测，扩增了543 bp相关片段，包含81 bp利福平耐药决定区，即密码子507～533区。共有63株发生突变，共检测突变类型18种，突变频率531位点58.73%(37/63)，526位点14.29%(9/63)，516位点4.76%(3/63)。有59株突变发生在利福平耐药决定区(即密码子507～533区)，利福平耐药决定区突变频率为93.65%(59/63)，比例法药敏试验72株耐药菌株中有11株没有检测到突变，63株敏感菌株中2株检测到突变。

表2 NGS检测结核分枝杆菌是否耐药的效能

表3 136株结核分枝杆菌对5种药物耐药的相关基因突变类型及频率分析

续表3

4.链霉素：对链霉素耐药相关基因rpsL进行检测，53株发生突变，有2种突变类型，rpsL43突变42株,突变频率为79.25%(42/53)；rpsL88突变11株，突变频率为20.75%(11/53)。比例法药敏试验69株耐药菌株中有18株没有检测到突变，66株敏感菌株中有2株检测到突变。

5.氧氟沙星:对氧氟沙星耐药相关基因gyrA、gyrB进行检测，21株发生突变，有4种突变类型，gyrA94突变16株，突变频率为76.19%(16/21)；gyrA90突变了2株，突变频率为9.52%(2/21)；gyrA91突变2株，突变频率为9.52%(2/21)。比例法药敏试验29株耐药菌株中有9株没有检测到突变，106株敏感菌株中有1株检测到突变。

讨 论

目前认为，引起结核分枝杆菌的耐药机制主要包括细胞壁结构与组成的变化，使其通透性改变、耐药质粒或者转座子介导的耐药、酶失活，靶基因的突变等因素，其中最主要引起结核分枝杆菌耐药的原因是基因突变[5]。本研究NGS技术检测与比例法药敏试验相比，检测异烟肼、乙胺丁醇耐药的敏感度均达到85%以上，检测异烟肼、利福平、链霉素、氧氟沙星耐药的特异度均达到96%以上，检测异烟肼、利福平、氧氟沙星一致性较好。

异烟肼耐药机制相对来说较为复杂，本研究通过对异烟肼耐药相关基因inhA、katG、ahpC间隔区进行检测分析，80株耐药结核分枝杆菌菌株中，异烟肼耐药相关基因katG基因突变率为88.75%(71/80)，主要位于315位点，占katG基因突变的97.18%(69/71)，315位点密码子由AGC突变成ACC,丝氨酸变为苏氨酸，这与美国学者的报道基本一致[6-7]。ahpC间隔区突变率为1.23%(1/81)，该位点突变与INH耐药后的代偿有关，与INH无直接联系，它联合katG142位点突变，与上海的一项研究[8]的结果有差异，主要与异烟肼耐药相关基因突变特征因地域的不同而有明显的差异。

embB基因突变是对乙胺丁醇耐药的主要分子机制[9-10]。21株对乙胺丁醇耐药的菌株中18株发生突变，embB基因突变率为85.71%(18/21)。16株embB基因突变主要发生在306位点，突变率为88.89%(16/18)。对乙胺丁醇敏感的114株中测出11株embB306、4株embB406位点突变，共15株突变菌株，突变率为13.16%(15/114)，乙胺丁醇embB基因耐药检测特异度较低。

利福平耐药主要由rpoB基因突变引起，本研究72株对利福平耐药的菌株中，61株发生突变，rpoB基因突变率达84.72%(61/72)。61株rpoB基因突变的耐药菌株中，突变主要发生在rpoB531位点，突变率为57.38%(35/61)，rpoB526突变率为14.75%(9/61);rpoB511位点突变率为9.84%(6/61)；rpoB516位点检出率为4.92%(3/61)，rpoB531、526、511、516位点占全部rpoB基因突变的83.61%(51/61)，检出rpoB522位点突变菌株2株，与陈燕等[11]的研究一致。57株菌株突变位点位于利福平耐药决定区(RRDR)，1株发生ropB126CCG-TCG突变，3株发生ropB251GTC-TTC突变，这4株不在利福平耐药决定区。可见，检测rpoB基因发生突变来检测利福平结核分枝杆菌耐药性具有较高的可靠性，rpoB基因突变的突变率为83.56%(61/73)，低于陈燕等[11]、Yuan等[12]的报道，原因可能为地域的不同，位点所占比例有差异，12株耐药菌株未检测出rpoB突变，不排除其他基因突变引起或存在其他耐药机制。

链霉素的耐药主要是rpsL和rrs的基因突变引起的[13-14]，本研究中69株对链霉素耐药的菌株中51株发生突变，rpsL基因突变率为73.91%(51/69)，没有检测到rrs突变类型。51株rpsL基因突变主要发生在43和88位点上，44位点的突变率为78.43%(40/51)，88位点的突变率为21.57% (11/51)。这与Tracevska 等[15]流行病学调查的耐链霉素结核分枝杆菌临床分离株rps和rrs基因突变的结果一致。

氧氟沙星的耐药突变主要在gyrA基因和gyrB基因型上。本研究中29株对氧氟沙星耐药的菌株中，gyrA的突变率为68.97%(20/29)；与陈燕等[11]的研究结果一致。gyrA的突变主要发生在94和90位点上，gyrA94位点突变者有16株，占总突变的84.21%(16/19)；gyrB的突变率为3.45%(1/29)。

NGS可准确识别包括单核苷酸多态性(SNP)、小片段插入和缺失等各种遗传多态性信息，50多个与结核耐药相关的高频及低频突变都能检测到，一次性可检测多个样本，具有通量高的检测优势，对利福平、异烟肼、氧氟沙星耐药的检测效能较好，能够满足临床耐药结核病诊断的需要。NGS对乙胺丁醇、链霉素已知耐药位点的检测效能一般，需要对其耐药机制进行进一步的研究。