乳腺癌分子分型与遗传基因变异谱关系的初步探讨

廖健伟 邵佳佳 王鹏 蒋圆玲 萧晓琴 彭小芳 李晓娟 欧阳能太*

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤［1］，约5%-10%的乳腺癌为家族遗传性［2］。通过发现致病性基因变异以寻找患癌高风险人群至关重要，潜在的患者可通过早期的临床干预以降低患癌风险。BRCA1 和BRCA2 基因作为乳腺癌的重要基因，已知与卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌的遗传风险相关，并已列入NCCN 指南［3］。然而，早在2015 年就有研究对包括BRCA1/2 在内的10 多个基因进行乳腺癌患癌风险分析［4］，显示出肿瘤遗传基因的复杂性。如今随着高通量技术的发展，临床可一次性同时检测多个基因，得到更多的基因信息，因此多基因测序显示出更大的临床价值。中国是乳腺癌高发的国家，已有研究通过多基因检测试图分析我国乳腺癌人群的遗传变异，但研究的基因数相对较少［5］。以ER、PR、HER2、Ki67 的表达作参考，乳腺癌可分为Luminal A、Luminal B、HER2 过表达、三阴型4 种亚型。不同分型的治疗方案和预后有所差别。然而，针对不同的乳腺癌分型的遗传变异谱研究较少。本研究旨在通过高通量测序技术，检测并分析与肿瘤遗传易感相关53 个基因，了解不同乳腺癌分型的遗传基因变异情况，为不同分型乳腺癌的临床诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料取中山大学孙逸仙纪念医院收集的乳腺癌患者外周血本66 例，平均（45.23±9.89）岁，所有病例均经病理科确诊均为乳腺癌并作病理分子分型。本研究过程不涉及患者隐私和商业利益，经我院伦理委员会批准实施。

1.2 DNA 提取及靶向捕获测序外周血白细胞的DNA 提取用艾德DNA 提取试剂盒（艾德，厦门）。测序建库采用肿瘤遗传易感基因检测试剂盒（燃石，广州），流程如下：取200 ng DNA，用Covaris M220（Covaris，MA，USA）进行打断，接着依次进行末端修复、磷酸化和接头连接。然后将200-400bp 的片段经过探针杂交、磁珠纯化、PCR扩增形成目的文库，将文库进行定量，在Nextseq550 测序仪（Illumina，Inc.，USA）进行2 X 150bp 双端测序检测，检测53 个与肿瘤遗传相关基因，平均测序深度100X，检测基因包括ATM，BARD1，BRIP1，BRCA1，BRCA2，CDH1，PALB2，RAD51C，RAD51D，CHEK2，NBN，TP53，PTEN，STK11，APC，MUTYH，EPCAM，MLH1，MSH2，MSH6，PMS2，BMPR1A，SMAD4，GREM1，KIT，PDGFRA，HOXB13，RB1，PTCH1，CDK4，CDKN2A，PALLD，WRN，MEN1，RET，SDHB，SDHC，SDHD，SDHA，SDHAF2，TMEM127，MAX，VHL，MET，FH，FLCN，TSC1，TSC2，PRKAR1A，SMARCA4，SMARCB1，BRAF，GNAS。

1.3 生物信息分析变异主要通过与人类参考基因组hg19 版本比较得出。变异分析类型主要包括单碱基变异和短片段插入缺失，涵盖相关基因的全外显子区及内含子区交界区约20bp。变异致病性判定主要依据ACMG 指南2015 版，通过收集证据如人群数据库、疾病数据库、计算机预测、功能研究等进行评分，最后将基因变异分为良性变异、可能良性变异、临床意义未明变异、致病性变异（包括可能致病变异和致病变异）。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件进行数据处理，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 66例外周血样本的基因变异情况如图1所示，在本次研究的66 名患者中，约16.7%（11/66）患者携带致病或可能致病基因变异，约68.2%（45/66）患者携带意义未明变异，约有15.1%（10/66）患者携带良性或可能良性基因变异。除去良性或可能良性基因变异，共检测出基因变异108 个，含11个致病或可能致病基因变异，约占10.2%，其中BRCA2 占4%。

图1 基因变异分类情况

2.2 不同乳腺癌分子分型的基因变异情况依据ER、PR、HER2、Ki67 的表达情况对乳腺癌患者进行分组，进一步分析不同分子分组的基因变异。通过比较排名前五位的变异基因我们发现，Luminal A 型，22 例，其中5 例为良性，其余17 例共检出46 个基因变异，主要变异为错配修复基因如MLH1/MSH2/MSH6/PMS2、BRCA2、ATM、PTCH1、BARD1（表1）。Luminal B 型，25 例，其中2 例为良性，其余23 例共检出44 个基因变异，其中有6 个BRCA2 变异，5 个BRCA1 变异，4 个错配修复基因变异（表2）。HER2 过表达型，5 例，2 例良性，其余3 例检出8 个基因变异，未发现BRCA1/2 基因变异（表3）；三阴型，14 例，1 例良性，其余13 例共检出23 个基因变异，其中有3 个FLCN 基因变异，MLH1/MSH2/MSH6/PMS2 变异有2 个，BRCA2 基因变异2 个（表4）。人均变异数最多为Luminal A型，最少为HER2 过表达型。

2.3 致病性基因变异分布情况携带BRCA1/2意义未明变异的患者约占所有患者的16.67%（11/66），携带BRCA1/2 致病性变异的患者约占10.6%（7/66）。如表5 所示，致病性变异发生频率最高的基因为BRCA2。其中，Luminal A 型有2 个BRCA2致病变异，1 个BARD1 致病变异、1 个TP53 致病变异；Luminal B 型 有3 个BRCA2 致 病 性 变 异，2 个BRCA1 致病变异；HER2 过表达型未发现致病性变异；三阴型有2 个致病性变异，分别为MSH2、SDHC。

表1 Luminal A 型乳腺癌基因变异前五位结果

3 讨 论

肿瘤遗传易感性基因检测对于寻找高风险患癌人群并进行必要的临床管理至关重要。然而，不同的乳腺癌亚型是否有不同的遗传变异规律仍不清楚。本文采用高通量测序的方法，通过检测53 个肿瘤遗传相关基因进一步对不同亚型乳腺癌患者的遗传基因变异谱进行分析。我们发现，同源重组修复基因是乳腺癌患者发生频率最高的变异基因。其中，BRCA1 和BRCA2 共检出18 个基因变异，我们的结果显示携带BRCA2 基因变异的患者多于携带BRCA1 基因变异的患者，与先前的报道一致［6］。进一步分析发现，BRCA1/2 是Luminal A 和B 型乳腺癌患者最常见的变异基因（16/78），也是其最主要的致病性变异基因，约占所有致病性变异的77.78%（7/9）。有研究表明，CHEK2 和PALB2 是Luminal 型乳腺癌常见的变异基因，但是本研究并未发现CHEK2 基因变异，可能受样本数制约。

HER2 过表达组的患者适用赫赛汀治疗。已有研究发现，HER2 的表达与BRCA1/2 无明显相关性［7］。其它中国人群的研究结果显示，TP53 是最常见的非BRCA 变异基因［5］，其变异频率与HER2表达相关，HER2 阳性的年轻乳腺癌患者一般携带TP53 变异。但是本研究中，HER2 过表达组未发现TP53 基因变异，可能是研究病例数较少和入组人群标准不同所致。三阴型乳腺癌占乳腺癌约15%，致死率较高。BRCA1 变异的乳腺癌中，约三分之一为三阴型乳腺癌［8］。但本研究的三阴型乳腺癌未发现BRCA1 变异。 我们发现1 例SDHCc.242-1G>A 变异的三阴性乳腺癌患者。SDHC 编码琥珀酸脱氢酶，参与组成线粒体电子传递链，已知与胃肠间质瘤、副神经节瘤有关，与乳腺癌的相关性仍不明确，提示部分乳腺癌的遗传变异可能与代谢基因异常有关。但由于本研究的病例数较少，以及检测基因数有限，结果及临床意义有待进一步观察。

表2 Luminal B 型乳腺癌基因变异前五位结果

表4 三阴型乳腺癌基因变异前五位结果

表5 不同乳腺癌分型的致病性基因变异情况

值得关注的是，在本研究中携带非BRCA 基因变异的患者占所有乳腺癌患者超过了70%，约为72.7%（48/66）。尽管多数基因变异仍属于临床意义未明，临床上如果单独检测BRCA1/2 基因可能会导致漏检。在本研究中，错配修复基因MLH1/MSH2/MSH6/PMS2 是乳腺癌患者发生频率第二高的变异基因，共检出13 个基因变异。进一步的分子分型发现，错配修复基因变异在Luminal A 组、HER2 过表达组、三阴组的变异发生率甚至高于BRCA1/2。另外，我们还发现TP53、BARD1 致病变异，TP53 主要参与周期调控，BARD1 参与同源重组修复，都是细胞稳态的重要调控基因。

综上所述，DNA 损伤修复通路在乳腺癌的发生发展中可能起着重要作用。BRCA1 和BRCA2基因是最重要的乳腺癌遗传易感基因，但是存在较多的非BRCA1/2 的基因变异可能与乳腺癌易感性相关。因此，临床上应尽可能扩大基因检测范围，除了同源重组修复基因，建议同时检测其它DNA 修复相关基因，以减少漏诊。