异硫氰酸荧光染色法在真菌性角膜炎诊断中的应用观察

真菌性角膜炎是我国常见的高致盲率的眼病, 部分患者需行角膜移植手术来保住眼球或获得有用视力；然而全国仅有较少的医院开展角膜移植手术，同时角膜来源有限，给真菌性角膜炎的治疗带了困难。如能在早期正确诊断真菌性角膜炎，并给予及时有效的抗真菌治疗，部分患者可恢复一定有用视力，避免了角膜移植手术。因此，早期正确、高效的真菌病原学检测，对真菌性角膜炎的预后有着十分重要的意义。我们在2019年1～5月使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) 荧光染色法在真菌性角膜炎的诊断中取得良好的临床效果，现报告如下。

资料与方法

一、一般资料

收集2019年1～5月在十堰市太和医院眼科诊断为角膜炎，并通过角膜刮片行KOH涂片、革兰染色及FITC荧光染色法检查的42例(42只眼)患者的资料；其中住院患者治疗40例，门诊患者2例。其中男性33例，女性9例；年龄7～86岁，平均年龄(62.2±16.2)岁。

二、检测方法

患者患眼采用爱尔凯因滴眼液表面麻醉,开睑器开睑，用无菌11号尖刀片刮取靠近溃疡边缘部位组织，在载玻片上均匀涂开。分别刮3个载玻片，1个送皮肤科行FITC荧光染色法检测，另外2个分别送KOH涂片及革兰染色检查。

FITC荧光染色法：在涂有角膜病灶刮片物的载玻片上滴立特晰荧光液(FITC，安徽合肥华今生物科技有限公司)1滴，加盖玻片，吸除多余的染色液(10 s)。将载玻片放置在莱卡DM 500荧光显微镜的水平操作台上，先用低倍镜找到样本所在区，再用高倍镜寻找菌丝或孢子等结构，通常在1 min中内完成。FITC荧光染色法检测由皮肤科高级技师完成。

KOH涂片法：向涂有角膜病灶刮片物的载玻片上滴1滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，酒精灯火焰上方稍加热20～30 s将载玻片放置在奥林巴斯 CX21普通光学显微镜的水平操作台上，先用低倍镜找到样本所在区，再用高倍镜寻找菌丝或孢子等结构。KOH湿片法检查由检验科高级技师完成。

革兰染色法：(1)在涂有角膜病灶刮片物的载玻片上滴1滴脱色液(丙酮+95%乙醇，1:3)固定，自然挥发干燥。(2)加龙胆紫染色10 s,自来水冲洗，甩干。(3)加碘液染色10 s，自来水冲洗，甩干。(4) 加脱色液(丙酮+95%乙醇，1:3)10～20 s，自来水冲洗，甩干。(5)加沙黄溶液10 s，自来水冲洗。(6)以滤纸吸干。将染好的载玻片放置在奥林巴斯 CX21普通光学显微镜的水平操作台上，先用低倍镜找到样本所在区，再用高倍镜寻找菌丝、孢子或细菌等结构。革兰染色法检查由检验科高级技师完成。

真菌病原学检测阳性：KOH涂片、革兰染色涂片及FITC荧光染色法中任何1种为阳性即为真菌病原学检测阳性。

细菌病原学检测阳性：KOH涂片或革兰染色涂片中任何一种细菌检测为阳性即为细菌病原学检测阳性。

三、病原学检测阴性患者的临床诊断

1.真菌性角膜炎：对于临床表现符合真菌性角膜炎的患者，但真菌病原学检测阴性者，行那他霉素眼水及特比奈芬眼水抗真菌治疗，根据病情确定是否需联合扩瞳及普拉洛芬眼水。如临床治疗有效，临床诊断为真菌性角膜炎。

2.病毒性角膜炎：真菌及细菌病原学检测阴性，临床特点符合病毒性角膜炎，使用更昔洛韦眼胶、贝复舒眼胶等眼药治疗有效者，临床诊断为病毒性角膜炎。

3.细菌性角膜炎：真菌及细菌病原学检测阴性，但怀疑细菌感染，怀疑革兰阴性细菌者，使用可乐必妥联合或不联合头孢唑林滴眼液；怀疑革兰阴性细菌感染：使用可乐必妥滴眼液联合头孢他啶滴眼液，根据病情确定是否需联合扩瞳及非甾体滴眼液或激素滴眼液。临床治疗有效者，临床诊断为细菌性角膜炎。临床诊断患者，至少随访1个月。

四、统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用卡方检验比较FITC荧光染色法与KOH涂片法联合革兰染色法的真菌检出率，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

FITC荧光染色法在荧光显微镜下观察到染呈亮绿色的真菌菌丝或孢子，背景呈黑色，与背景反差较大。其中菌丝表现为单根至大量不等的竹节样结构，周围少许蓝色光晕(图1，2)；孢子表现为圆形、椭圆形结构，周围有少许蓝色光晕(图3)。细菌则不能显示。KOH涂片法在白色背景中见空心的条状菌丝(图4)，孢子不易辨认。革兰染色下菌丝表现分红色棒状物(图5)，孢子表现为圆形或椭圆形，胞核为蓝色，胞质为红色(图6)。

42例患者中FIFT荧光染色法检出菌丝和或孢子共12例；KOH涂片和革兰染色涂片共发现菌丝和或孢子7例。真菌病原学检测阳性13例。另有1例植物外伤的患者，真菌病原学检测阴性，但临床表现与真菌性角膜炎相似，抗真菌治疗后好转，因此临床考虑真菌性角膜炎。共诊断真菌性角膜炎14例，其中病原学诊断13例和临床诊断1例。本研究中FITC荧光染色法在诊断真菌性角膜炎的检出率为85.7%，高于KOH涂片法联合革兰染色法的50%，P<0.05，差异有统计学意义。

其余28例患者中KOH涂片和革兰染色涂片共发现细菌15例，其中革兰阳性球菌7例、革兰阴性杆菌5例及革兰阳性球菌合并革兰阴性杆菌3例。其余13例患者中临床诊断为病毒性角膜炎且抗病毒等对症治疗有效3例；剩余10例考虑为细菌性，其中8例抗感染治疗后好转，2例改善不明显转往上级医院行进一步治疗。

讨 论

目前真菌性角膜炎诊断常用方法有角膜刮片、真菌培养、共聚焦显微镜检查及角膜组织病理检查等。角膜刮片和真菌培养法作为传统的真菌检测方法，为目前真菌诊断的金标准。活体共聚焦显微镜检查作为一种无创性检查，无需组织切片、固定及染色即可多层次立体地对角膜组织进行实时成像，可对真菌性角膜炎疾病早期进行诊断、明确感染深度、了解治疗效果及确定停药时间等[1]；同时对于真菌刮片及培养阴性的患者亦有较高的检出率[2]。角膜共聚焦检查要求患者良好的配合，避免因运动伪影而影响检查结果；对于致密角膜浸润灶或角膜疤痕患者，其渗透性及可视性面临巨大的挑战。此外，对于非首诊、已接受过诊断性治疗或角膜刮片检查可导致真菌菌丝被破坏而出现假阴性的结果[3]；同时该设备较为昂贵，需专业人员解读结果。综合以上因素，活体共聚焦显微镜在真菌性角膜炎诊断中的使用也受到了一定程度的限制。培养法可以鉴定菌种，但培养周期长，一般需1～2周时间，阳性率较低，不利于真菌性角膜炎的早期指导用药。角膜病理检查可鉴定菌种、进行药物敏感性实验，指导临床用药。但培养通常需切取一定量的角膜组织，对角膜有一定的创伤；同时费用较高、耗时长[4]，比较适合用于行角膜移植手术后对原角膜疾病的检查，因而在未开展角膜移植手术的医院开展较少。角膜刮片应用最为广泛，其中10%KOH涂片法虽然应用最广，具有诊断快、操作简便等优势, 但其检测结果符合率偏低, 存在一定的假阳性结果, 容易造成误诊或漏诊从而影响患者的临床治疗，同时对检查者技术要求较高。陈薇婴[4]报道真菌性角膜炎患者KOH涂片阳性率为77.3%。革兰染色法通常作为KOH涂片的补充检查，可用于革兰阳性及阴性细菌的识别，真菌革兰染色法阳性率较低，同时革兰染色涂片中隐球菌或白色念珠菌显示为圆形、胞核为蓝色，胞质为红色，与淋巴细胞较为相似，当病原体量少时容易误认为淋巴细胞，或者少量淋巴细胞被误诊为真菌孢子。此外革兰染色法相对操作较为复杂。但一项大型的临床研究显示共聚焦显微镜在真菌性角膜炎中的检查率高达89%，但角膜涂片法诊断率高达96.5%[5]。蒲琪等[6]发现在31例非首诊的真菌性角膜炎诊断中，真菌培养阳性率为58%，角膜共聚焦的检出率为19%。因此在非首诊的可疑真菌性角膜炎的诊断中不应过度重视角膜共聚焦检查而忽略常规的角膜刮片及培养。真菌荧光染色法是指通过特殊荧光素标联几丁质酶，与真菌细胞壁中的几丁质或纤维素产生特异性的结合，并吸收紫外光，使菌丝、孢子发出亮绿色荧光，在荧光显微镜下表现为亮绿色的真菌轮廓与黑暗背景，对比鲜明[7]。荧光染色剂Calcofluor White(CFW)在真菌性角膜炎中显示出较高的检出率[8]。刘先宁等[9]发现丫啶橙荧光染色法在真菌性角膜炎的可取得较高的检出率。FITC是另一种易溶于水及酒精等溶剂中的黄色结晶粉末荧光染色剂。韩德忞等[10]将FITC荧光染色法用于真菌性皮屑及甲屑等真菌检查，真菌检出率高达97%，远高于KOH涂片法。徐艳等[7]的研究结果也支持这一研究结论。阎艳等[11]发现FITC荧光染色法在真菌性角膜炎患者切取的角膜标本中的检出率为97.4%。尽管上述两研究显示FITC荧光染色法在真菌组织的检查率极高，但两者病变组织的取材相对较多。张阳等[12]在一项105例真菌性角膜炎的病例研究中发现角膜涂片的FITC荧光染色法诊断真菌感染的敏感性是97.0%，高于角膜共聚焦显微镜检查(87.9%)、涂片吉姆萨染色(86.7%)及真菌培养(69.7%);同时FITC荧光染色法可以显示阿米巴的包囊，但未检出阿米巴滋养体，这与阿米巴包囊含有几丁质囊壁而滋养体不含有关。本研究中使用角膜刮片法送检，取材量相对较少，但FITC荧光染色法真菌的检出率仍高达85.7%，远高于本研究中KOH法联合革兰染色法的50%。本研究中KOH涂片法的真菌检出率与Ferrer等[13]报道的 59.3%比较接近，但低于Gopinathan等[14]报道的91%，考虑与该研究中病例样本量、刮片医师技巧及检验科技师诊断水平等原因有关。同时FITC荧光染色法中淋巴细胞不会显示，念珠菌或白色念珠菌表现为黑色背景上的亮蓝色；因此不易漏诊，但隐球菌与白色念珠菌不易鉴别。但FITC荧光染色法也有一定的缺点，首先需要荧光显微镜；其次，需要较为昂贵的FITC试剂。再次，对于真菌性角膜炎合并有细菌感染的患者，单纯的FITC荧光法可能出现漏诊。最后，如果是感染灶仅位于角膜深基质或内皮面，角膜上皮完整、角膜浅基质没有病灶，基于角膜刮片的FITC荧光染色法将对临床将无所帮助[15]。

FITC荧光染色法具有快速、高效的真菌检出率，且操作简单，非常值得临床推广使用，同时FITC荧光法在非真菌性角膜炎有良好的排除诊断作用，建议将FITC荧光染色法作为可疑真菌性角膜炎的首选检查方法。