lncRNA SNHG1结合miR-145促进胃癌细胞增殖的机制研究

周锋利， 褚以忞， 李 吉， 杨大明， 彭海霞， 徐 莹

（上海交通大学医学院附属同仁医院内窥镜室，上海 200336）

胃癌是我国发病率较高的恶性肿瘤[1]。目前,胃镜筛查尚未在我国全面推广，多数胃癌患者就医时已处于进展期，5年生存率低，预后往往不佳[2-3]。因此，深入研究胃癌的发病机制对提升临床治疗效果有重要的价值及意义。

随着肿瘤发病机制研究的不断丰富，以往曾被认为是无功能的非编码RNA在肿瘤发病机制中的作用逐渐被关注。长度大于200 nt的非编码RNA为长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。目前研究表明，肿瘤中有大量lncRNA的表达异于正常组织[4-5]，在肿瘤的发生、发展起重要生物学作用[6]，这使得lncRNA有作为肿瘤生物标志物和治疗靶标的潜力[7-8]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长19～25 nt非编码蛋白的调控小RNA，近年来有大量研究表明，其对肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭以及远处转移等均能产生影响，在肿瘤的诊断中一定的价值[8-12]。

lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）在染色体上位于11q12.3。有研究结果显示，SNHG1水平在多种肿瘤中升高[13-16]，并可调控肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、Y染色体性别决定区域盒转录因子9（sex determining region Y-box transcription factor 9，SOX9）、锌指E-盒结合同源异形盒1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）等及其所在信号通路[17]。有研究结果显示，SNHG1在胃癌中呈高表达[14]，其表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、生存期有一定关系[18]。微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）在胃癌组织中呈低表达，过表达miR-145有抑制胃癌细胞增殖和迁移的作用[19-21]。SNHG1可通过海绵吸附miR-145，促进结肠癌细胞的增殖[22]，但两者在胃癌中是否有相互作用，并影响胃癌细胞增殖仍有待进一步研究。鉴于SNHG1及miR-145在胃癌组织中的异常表达及对患者预后的影响[14，18]，本研究拟探讨SNHG1与miR-145在胃癌发展中可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

本研究使用的细胞株及pcDNA3.0空载质粒均由上海交通大学医学院生化系侯照远教授实验室惠赠；Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、RPMI1640、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自美国Gibco公司；CCK8试剂盒购自日本Dojindo公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告试剂盒及质粒载体购自美国Promega公司；β-连环蛋白（beta-catenin，CTNNB1）兔单克隆抗体、骨髓瘤病毒原癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）蛋白兔单克隆抗体购自美国CST公司；β-肌动蛋白鼠单克隆抗体购自美国Proteintech公司；二抗购自美国Li-COR公司。

1.2 细胞培养与组织收集

人胃癌细胞SGC7901、BGC823用RPMI1640培养基培养，人肾上皮细胞HEK 293T、人正常胃黏膜细胞GES-1细胞用DMEM培养基培养，培养基中均含10% FBS、青霉素50 U/mL、链霉素50 μg/mL及L-谷氨酰胺20 mmol/L，于37℃、5% CO2培养箱中培养。收集上海交通大学医学院附属同仁医院2016年1月—2017年1月17例胃癌术后患者的胃癌组织及癌旁组织，17例患者中男12例、女5例；年龄≤60岁4例、＞60岁13例；TNM分期为Ⅰ期+Ⅱ期7例、Ⅲ期+Ⅳ期10例；病理类型为腺癌13例、印戒细胞癌4例。

1.3 转染过表达SNHG1、miR-145及敲低SNHG1

将SNHG1互补DNA（complementary DNA，cDNA）序列（Ensembl：ENSG00000255717，MIM：603222）插入到pcDNA3.0空载质粒中，并按照文献[23]报道的方法进行质粒转染，在SGC7901、BGC823及GES-1中过表达SNHG1。人miR-145双链模拟体、SNHG1抑制剂及阴性对照（negative control，NC）由上海吉玛生物技术有限公司合成，N C双链信息：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3'，5'-AC GUGACACGUUCGGAGAATT -3'。人miR-145双链模拟体：5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAU CCCU-3'，5'-GGAUUCCUGGGAAAACUGGAC UU-3'。SNHG1-homo-128（si-SNHG1-1）：5'-GCCAGCGUUACAGUAAUGUTT-3'，5'-ACA UUACUGUAACGCUGGCTT-3'；SNHG1-homo-582（si-SNHG1-2）：5'-GGUUUGCUGUGUAU CACAUTT-3'，5'-AUGUGAUACACAGCA AACCTT-3'。按说明书方法进行转染过表达miR-145及敲低SNHG1。

TRIzol法提取细胞和组织中的总RNA，逆转录后行实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）定量分析。以小核RNA U6（RNA U6 nuclear small，snRNA U6，U6）为miR-145的内参，以β-actin为SNHG1的内参。miR-145引物序列为：上游5'-CGACCGTCCAGTTTTCCCAGGA-3'，下游5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。U6引物序列为：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。SNHG1引物序列为：上游5'-ACACTGGGAGCC AATGAAACA-3'，下游5'-ACACGAAGTGG AGTTATGGGAAG-3'。β-actin引物序列为：上游5'-GTCACCAACTGGGACGACA-3'，下游5'-CACAGCCTGGATAGCAACG-3'。转染、TRIzol法提取细胞RNA、逆转录后行qRT-PCR。所有实验均重复3次。

1.4 CCK8及免疫印迹法实验

CCK8实验中，将目的细胞以1 000个/孔接种于96孔板，每组设3个复孔；在培养的第2、24、48、72、96 h加入CCK8试剂10 μL/孔，孵育1 h后酶标仪测定450 nm吸光度。实验重复3次。免疫印迹法实验中，裂解细胞后，进行蛋白定量、等量蛋白电泳、转膜、封闭，孵育一抗、二抗后，用Odyssey Li-COR 9120荧光扫描仪（美国Li-COR公司）进行荧光显影并记录，实验重复3次。

1.5 荧光素酶报告基因实验

为验证SNHG1有与miR-145的结合位点，构建含有SNHG1预测与miR-145结合位点的片段的psiCHECK2TM质粒，构建方法参考文献[23]。24孔板培养293T细胞至密度70%～80%，不同量的miR-145或NC与psiCHECK2TM-SNHG1的报告基因质粒同时共转染，24 h后按说明书操作收集并裂解细胞，设置双报告基因程序；先在裂解液中加入LARII试剂检测萤火虫荧光素酶的活性；之后再加入Stop & Glo Reagent试剂检测海肾荧光素酶活性；计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值，以此反映psiCHECK2TM-SNHG1的报告基因活性；将实验组比值除以miR-145 mimics 0 mg组比值，计算出psiCHECK2TM-SNHG1报告基因相对活性，实验重复3次。

1.6 生物信息学分析

使用Kaplan-Meier Plotter数据库（http：//kmplot.com/analysis/）分析SNHG1表达与胃癌生存期的关系。使用starBase v3.0数据库（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析胃癌组织与癌旁组织SNHG1的表达以及胃癌中SNHG1与miR-145、SNHG1与CTNNB1、SNHG1与MYC表达的相关性。采用TANRIC数据库（http：//ibl.mdanderson.org）分析胃癌与SNHG1表达的相关性以及可能与SNHG1存在相互作用的miRNA。通过RNA22 v2 microRNA target detection（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）网站预测SNHG1与miR-145可能的结合位点。

1.7 统计学方法

使用SPSS 21.0软件进行统计分析。2个组间比较采用t检验，非正态分布数据采用中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用非参数秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中SNHG1的表达及其与患者总生存期（overall survival，OS）的关系

在Kaplan-Meier Plotter数据库（http：//kmplot.com/analysis/）中使用数据集GSE14210（146例）、GSE15459（200例）、GSE22377（43例）、GSE29272（268例）、GSE51105（94例）进行生存分析。结果显示SNHG1高表达组（127例）中位OS为27.8个月，明显短于低表达组（221例，中位OS为35.9个月）[风险比（hazard ratio，HR）=1.4（1.06～1.83），P=0.015]，见图1（a）。

通过starBase v3.0数据库（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）查找发现，375例胃癌组织SNHG1的相对表达量为3.25（2.60～3.80），明显高于32例正常胃组织[1.91（1.52～2.32），P=1.4×10-14，错误发现率（false discovery rate，FDR）=4.3×10-13]，见图1（b）。

图1 SNHG1对胃癌OS期的影响及在胃癌及癌旁组织中的表达情况

对17例胃癌患者的胃癌组织及癌旁组织进行qRT-PCR检测，结果显示胃癌组织中SNHG1的相对表达量为25.35（4.51～65.12），明显高于癌旁组织[18.66（8.70～153.90）]（P＜0.05），见图1（c）。

2.2 SNHG1在胃癌细胞增殖中的作用

CCK8实验结果显示，培养48 h后，过表达SNHG1的胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖速率快于转染pcDNA3.0空载质粒的胃癌细胞系SGC7901和BGC823（P＜0.05），见图2（a）～（d）。

在胃癌细胞系SGC7901中敲低SNHG1的表达，采用CCK8实验检测细胞增殖速率。结果显示，与NC比较，培养48 h时转染siSNHG1-2的SGC7901细胞的增殖受抑制（P＜0.05）；培养72 h后，转染siSNHG1-1和siSNHG1-2的SGC7901细胞的增殖均受抑制（P＜0.05）。见图2（e）、（f）。

图2 SNHG1对胃癌细胞生长的影响

2.3 SNHG1与miR-145在胃癌细胞与组织中的相关性及特异性结合分析

利用生物信息学分析，通过TANRIC数据库（http：//ibl.mdanderson.org） 分析胃癌中与SNHG1表达的相关性以及可能与SNHG1存在相互作用的miRNA。结果显示，miR-145与SNHG1呈明显负相关（r=-0.421，P=1.17×10-4），见表1。进一步分析starBase v3.0数据库中372例胃癌患者组织中miR-145与SNHG1的相关性，结果显示，两者亦呈负相关（r=-0.37，P=3.81×10-13），见图3（a）。

在GES-1和SGC7901细胞中分别过表达SNHG1并采用qRT-PCR检测。结果显示，随着SNHG1表达的升高，miR-145表达降低（P＜0.05），见图3（b）、（c）。

通过RNA22 v2 microRNA target detection（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）网站预测到SNHG1与miR-145存在结合位点，见图3（d）。

荧光素酶报告基因实验结果显示，随着miR-145转染浓度的上升，SNHG1报告基因的相对活性呈浓度依赖性降低，见图3（e）。

表1 TANRIC数据库显示在胃癌中与SNHG1表达水平呈负相关的microRNA

2.4 SNHG1与miR-145结合对CTNNB1、MYC蛋白表达的影响

在starBase v3.0数据库中通过分析372例胃癌患者组织发现，SNHG1 mRNA表达与CTNNB1（r=0.12，P=0.025）及MYC（r=0.28，P=2.16×10-8）表达均呈正相关，见图4（a）、（b）。

将miR-145和SNHG1单独或共转染至GES-1细胞内，随后采用免疫印迹法检测CTNNB1和MYC蛋白的表达。结果显示，转染miR-145后，CTNNB1和MYC蛋白水平均明显降低；转染SNHG1后，CTNNB1和MYC蛋白水平明显升高；同时转染miR145和SNHG1后，miR-145下调CTNNB1和MYC蛋白的作用被明显抑制。见图4（c）～（f）。

图4 SNHG1与miR-145结合对CTNNB1、MYC蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，随着生活环境和饮食结构的改变，STAD发病率虽有所下降，但其死亡率仍居癌症死亡率的第3位，占总死亡人数的8.2%[24]。因此，探究胃癌发生、发展的机制，找到新的治疗靶点仍极为迫切。SNHG1是近年来新发现的一个lncRNA，目前发现其对多种肿瘤的发展及预后有关键作用，即可直接作用于信使RNA（messenger RNA，mRNA），也能通过海绵吸附miRNA，起到竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的作用，影响miRNA对下游靶基因的调控。例如，在结肠癌中通过影响p53通路促进细胞增殖[25]，肝癌细胞中竞争性结合miR-195，封闭其活性，从而促进疾病发展[26]，在肺腺癌中作用于ZEB1影响靶细胞的增殖、转移和侵袭等[27]。近来也有报道显示，SNHG1在胃癌中存在高表达，但其具体的分子作用机制尚未见详细阐述。褚以忞等[28]的研究结果显示，在胃癌及癌前病变组织中miR-145水平明显下降。miR-145可通过影响MYC水平来影响胃癌进展[21]。既往研究也证实，在卵巢癌、胃癌等多种肿瘤中MYC为miR-145的直接靶标[29-31]。同时，MYC也是T细胞因子的靶基因之一，受Wnt/β-catenin信号通路的激活调控[32-33]。

本研究首先通过Kaplan-Meier Plotter数据库发现，胃癌患者SNHG1表达与OS呈负相关，通过starBase v3.0数据库发现SNHG1在胃癌中高表达，与qRT-PCR的检测结果一致。本研究结果还显示，过表达SNHG1能促进胃癌细胞增殖，而敲低SNHG1则抑制胃癌细胞增殖。通过TANRIC、starBase v3.0数据库检索及细胞学实验证实SNHG1与miR-145表达呈负相关，使用RNA22 v2 microRNA target detection网站预测到SNHG1与miR-145存在结合位点，并通过荧光素酶报告基因实验证实两者能有效结合。通过starBase v3.0数据库分析胃癌患者组织发现，SNHG1表达与CTNNB1及MYC表达均呈正相关。分别过表达miR-145、SNHG1及同时过表达miR-145和SNHG1，发现miR-145可下调CTNNB1、MYC蛋白表达，SNHG1可促进CTNNB1、MYC蛋白表达，且SNHG1能抑制miR-145下调CTNNB1和MYC蛋白。由此可见，SNHG1在胃癌组织中呈高表达，且能结合miR-145，miR-145对SNHG1的影响呈浓度依赖性。原因可能是SNHG1或能通过海绵吸附miR-145，抑制miR-145对下游靶基因的作用，从而上调miR-145下游CTNNB1、MYC蛋白表达，促进胃癌细胞增殖。因此，SNHG1与miR-145的结合位点可能是胃癌的潜在治疗靶点。

由于本研究未用动物实验进一步阐明胃癌细胞中SNHG1和miR-145通过ceRNA上调CTNNB1、MYC蛋白表达的机制，因此SNHG1/miR-145/CTNNB1/MYC轴对胃癌发生、发展的影响还需进一步研究验证。