不同因素对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥大模型建立影响的比较研究

刘景艳,朱亮,蔡月琴,张利棕,富丹婷,蔡兆伟,王德军

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所,杭州 310053)

心血管疾病死亡率居于疾病死亡构成的首位,是威胁我国居民健康的头号杀手[1]。心肌肥大(cardiac hypertrophy,CH)是多种心血管疾病共有的病理特征,指心脏应对持续增加的心脏负荷的一种适应性代偿反应,主要表现为心肌细胞体积增大、心脏重量增加、间质细胞增生以及心肌重构等[2]。当长期负荷过重时,心脏会失代偿,心脏收缩功能衰退最终会导致心力衰竭,增加猝死发生率。虽然心肌肥大是最终导致心衰和死亡的主要原因,但由于其发生机制复杂,迄今没有有效防治心肌肥大的方法。因此,深入探讨影响心肌肥大发病的因素及其机制对防治心衰等心血管疾病显得极为重要。

建立稳定、可靠的动物模型是深入研究心肌肥大发病机制的关键环节。异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)是一种构建心肌肥大模型的常用药物,可导致大鼠心肌损伤坏死、纤维化及心室重构,同时伴随着心脏功能下降,表现出许多与人类心肌肥大相似的代谢和形态学异常[3-5]。目前皮下注射ISO诱导建立心肌肥大动物模型相关的研究较多,但使用的注射剂量差别很大,1～10 mg/kg范围均有报道。剂量过高或低对模型影响如何、动物存活率或死亡率之间是否有差异并不是十分清楚,缺乏客观有效的实验依据。另外,性别差异是近年来心血管疾病研究中容易忽视的科研盲点,并且也是导致很多动物实验结果难以重复的重要原因之一。研究发现,在容量负荷性大鼠和压力负荷性小鼠模型中,雌鼠多发生向心性肥大而雄鼠倾向于离心性肥大,并且雌鼠具有更高的室壁厚度[6-7]。Fliegner等[8]在慢性压力负荷引起的CH小鼠实验中发现,雄性小鼠相比雌鼠具有更多的心肌纤维化和凋亡。这些研究表明,注射剂量或性别不同对动物心肌肥大模型的建立都有显著影响,但ISO注射剂量高低对不同性别大鼠心肌肥大模型建立的影响如何却仍未见报道。

本项目采用不同剂量ISO进行颈背部皮下注射,建立雌性和雄性SD大鼠心肌肥大模型,观测超声心动图、血流动力学、心脏指数及组织病理学指标以及肥大基因(ANP、BNP)mRNA表达水平的改变,通过比较不同性别和注射剂量因素对大鼠心肌肥大模型建立影响的差异,为探索和优化大鼠心肌肥大模型的建立方法以及进一步研究心肌肥大的发病机制提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性和雌性SD大鼠56只,6～8周龄,体重200～220 g,由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供【SCXK(沪)2017-0005】。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心【SYXK(浙)2018-0012】,环境温度(22±2)℃,相对湿度50%～60%,光照:12 h/12 h明暗交替,噪声<50 dB;在IVC笼内饲养,自由饮食。所有实验步骤均按照中国关于实验动物使用和护理的立法进行,并经浙江中医药大学动物福利与伦理审查委员会批准(编号:IACUC-20190826-09)。

1.1.2 实验试剂

异氟烷(江苏恒丰强生物技术有限公司,20190801),乌拉坦(上海国药集团化学试剂有限公司,20130609),ISO(SIGMA公司,I5627-5G)Masson三色染色液(珠海贝索生物技术有限公司,20181026),苏木色精(上海伯奥生物科技有限公司,180701),曙红Y(国药集团化学试剂有限公司,20171112),DEPC处理水(生工生物工程(上海)股份有限公司,E625BA0016),逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司,RR036A),荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司,RR820A)。

1.1.3 实验仪器

Vevo2100小动物超声影像系统(Visual Sonics,加拿大);ALC-NIBP(8道)无创血压测定系统(上海奥尔科特生物科技有限公司,中国);ASP200S封闭式组织脱水机(Microm,德国);包埋机(Microm,德国);半自动石蜡切片机(Microm,德国);自动染色机(Microm,德国);数字病理切片(荧光)扫描分析仪(VS120-S6-W,Olympus,日本);iQ5型RT-PCR仪和PTC-200型PCR仪(美国BIO-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及实验干预

SD大鼠分为6组:雄性正常组(M C组,n=6)、雄性1.25 mg/kg(M 1.25 mg/kg组,n=11)、雄性5 mg/kg(M 5 mg/kg组,n=11),雌性正常组(F C组,n=6)、雌性1.25 mg/kg(F 1.25 mg/kg,n=11)、雌性5 mg/kg(F 5 mg/kg,n=11)模型组颈背部皮下注射ISO,正常组注射等量生理盐水,ISO干粉用生理盐水配置(2.5 mg/mL),连续注射10 d,期间大鼠自由饮食。每组随机选取仍存活大鼠各6只,进行相关统计学数据分析。

1.2.2 大鼠的一般情况观察

每天观察记录大鼠体重,注射ISO后饮食,活动,毛色,粪便,死亡等情况。

1.2.3 心脏重量参数测定

检测结束后,处死动物并迅速剖开胸腔取出心脏,剪去心房及周围结缔组织后用预冷的生理盐水冲洗心脏后用滤纸吸干,肉眼观察心脏大小并拍照,称重,电子天平准确称量全心重量(heart weight,HW),去除游离右心室后,称取左心室的重量(left ventricular weight,LVW),计算游离右心室重量(right ventricular weight,RVW)、全心重量/体重的比值(HW/BW)、左心室重量/体重的比值(LVW/BW)、游离右心室重量/体重的比值(RVW/BW)。

1.2.4 大鼠超声心动图测定

用高分辨率小动物超声影像系统,在二尖瓣腱索水平记录M型超声心动图,分别测量左室舒张末期室间隔厚度(left ventricular end-diastolic interventricular septal thickness,IVSd)、左室收缩末期室间隔厚度(left ventricular end-systolic interventricular septal thickness,IVSs)、左室后壁舒张末期厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、左室后壁收缩末期厚度(left ventricular end-systolic posterior wall thickness,LVPWs)连续3个心动周期的指标并取平均值。

1.2.5 大鼠心肌组织ANP和BNP基因mRNA表达水平

TRIzol法提取大鼠心肌组织总RNA,用逆转录试剂盒Prime Script TM RT reagent逆转录为cDNA,使用表1列出的引物将cDNA用实时荧光定量PCR仪进行Real time PCR扩增,所有反应信息资料由ABI StepOnePlus PCR仪收集,以GAPDH基因作为内参基因,采用2-△△CT法计算各组大鼠心肌组织ANP和BNP基因mRNA相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.6 大鼠血流动力学测定

20%乌拉坦麻醉大鼠(5 mg/kg),自颈中线切开皮肤,将微型导管经右颈总动脉插入直至左心室。稳定5 min后,测量大鼠心率(heart rate,HR)、左室收缩末压(left ventricular end-systolicpressure,LVESP)、左室舒张末压(left ventricular enddiastolicpressure,LVEDP)、左心室最大收缩速率(left ventricular pressure maximal rate of rise,dp/dtmax)、左心室最大舒张速率(left ventricular pressure maximal rate of fall,-dp/dtmax)等血流动力学指标。

1.2.7 大鼠心脏病理学观察

取心脏非心尖部分进行常规H&E和Masson染色后于光学显微镜下行心脏组织病理学观察。测量室间隔侧心内膜下层心肌细胞面积(选取近圆形细胞40个)、纤维化程度(计算纤维化区域10个镜头下的纤维化程度),取其平均值作为应测指标。

1.3 统计学分析

实验数据及图片使用GraphPad Prism 8和Image-Pro Plus 6软件处理,结果均采用平均值±标准差(±s)表示,组间比较采用One-way ANOVA方差分析,存活率采用log-rank检验,P<0.05表明差异具有显著性。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察

实验中发现,皮下注射ISO后,大鼠出现气喘,活动减少,饮水量增加,呼吸加快,口、鼻处有血性分泌物,猝死一般发生在注射ISO后15～35 min内,解剖可见肺部明显水肿和出血。由图1可见,正常组无死亡情况,雄性低、高剂量组存活率分别为63.6%、81.8%,雌性低、高剂量存活率分别为63.6%、55.0%。结果表明,雄性大鼠高剂量组存活率高,而雌性大鼠低剂量组存活率高,但各ISO处理组存活率之间无显著性差异(P>0.05)。

图1 ISO对大鼠存活率的影响(±s,n=6)Figure 1 Effect of ISO on rat survival rate(±s,n=6)

2.2 大鼠心肌肥大情况

由图2可见,各正常组大鼠心脏形态、大小无异常,而ISO处理组心脏体积均有不同程度的增大,且心尖外观局部可见灰白色。无论性别如何,两种剂量模型组大鼠HW/BW、LVW/BW、RVW/BW均显著高于正常组(P<0.01);雄性高剂量组大鼠HW/BW和LVW/BW值显著高于低剂量组(P<0.01),雌性大鼠高、低剂量组之间无统计学差异(P>0.05)。比较性别之间差异时,高剂量雄性大鼠LVW/BW值显著高于相同剂量雌性大鼠(P<0.01),而低剂量组雌雄大鼠之间无显著差异(P>0.05)。所以,剂量因素对雄性大鼠HW/BW、LVW/BW的影响呈剂量依赖关系,对雌性大鼠影响较小。

图2 大鼠心脏形态及重量参数(±s,n=6)Note.Compared with male normal group,∗∗P<0.01;Compared with female normal group,##P<0.01;vv P<0.01.(The same in the following Figures)Figure 2 Rat heart morphology and weight parameters(±s,n=6)

2.3 大鼠心脏超声指标变化

不同性别和剂量因素对大鼠心脏超声指标的影响见图3。雄性高剂量组心室壁(IVSd、IVSs、LVPWd)显著高于正常组(P<0.01),但雄性低剂量组心室壁厚度无显著变化(P<0.05)。雌性各剂量组心室壁(IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs)均显著高于正常组(P<0.01,P<0.05)。无论性别如何,上述指标在不同剂量之间均无显著性差异(P>0.05)。比较性别之间差异时,相同剂量下雌、雄大鼠心室壁厚度无显著性差异(P>0.05)。

图3 ISO对大鼠左心室壁厚度的影响(±s,n=6)Figure 3 Effect of ISO on the left ventricular wall thickness in rats(±s,n=6)

2.4 大鼠心肌组织肥大基因ANP、BNP mRNA表达水平变化

如图4所示,无论性别如何,两种剂量模型组动物心肌组织ANP、BNP基因mRNA表达水平均显著高于各正常组(P<0.05,P<0.01),且雄性高剂量组ANP基因mRNA表达水平显著高于雄性低剂量组和雌性高剂量组(P<0.01),但雌性各剂量组之间ANP、BNP基因mRNA表达水平无显著性差异(P>0.01)。

图4 大鼠心肌组织ANP、BNP mRNA表达水平变化(±s,n=6)Figure 4 Changes of mRNA expression levels of ANP and BNP in myocardial tissue of rats(±s,n=6)

2.5 大鼠血流动力学参数变化

由图5可知,雄性高剂量组动物HR、LVESP(P<0.05)、LVEDP、dp/dpmax、-dp/dpmax绝对值显著低于正常组动物(P<0.01),而低剂量组LVESP却显著增加(P<0.01),且雄性高剂量组LVESP、-dp/dpmax绝对值也显著低于低剂量组(P<0.01)。雌性高、低剂量组动物HR、LVESP、LVEDP、dp/dpmax、-dp/dpmax绝对值均显著性低于正常组动物(P<0.01),且低剂量组LVEDP、dp/dpmax绝对值显著低于高剂量组(P<0.01)。比较同一剂量下性别差异时发现,雄性低剂量动物LVESP、-dp/dpmax绝对值显著高于雌性低剂量组动物(P<0.01),但高剂量下雌、雄动物之间无显著性差异。

图5 大鼠左心室心功能指标变化(±s,n=6)Figure 5 Changes of left ventricular function indexes in rats(±s,n=6)

2.6 大鼠心肌细胞形态学表现

2.6.1 心肌组织H&E染色结果

H&E染色结果发现,雌、雄正常组心肌细胞排列整齐,间隙清晰,细胞核椭圆且位于细胞正中;各ISO处理组心肌细胞均排列紊乱,间隙增宽,心肌细胞面积增大,细胞核变形;左心室心内膜下层局部组织有散在小灶性及条索状坏死,心肌细胞水肿,有大量炎症细胞浸润及胶原纤维增生,局灶性坏死病理改变明显(图6)。

图6 大鼠心肌组织H&E染色Figure 6 H&E staining of rat myocardial tissue

2.6.2 心肌组织Masson染色结果

图7结果显示,与各正常组相比,ISO处理组左心室心内膜下层局部组织有大量胶原纤维增生,心肌纤维染色阳性区域增多,在内皮下区域的肌内膜中有大量的条索状及斑片状纤维组织沉积,且室间隔侧心肌细胞横截面积和心肌组织纤维化程度均显著增大(P<0.01)。同性别高、低剂量比较和同剂量不同性别比较时,大鼠室间隔侧心肌细胞肥大和纤维化程度均无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论

神经内分泌系统的激活在心肌肥厚的形成机制中扮演重要角色[9-10]。已有许多研究证实,高肾上腺素活性与心肌肥厚的发生相关[11-12]。ISO是一种非选择性β-肾上腺素受体激动剂,其诱发心室重构的作用得到研究者广泛认可和应用,采用此法诱导心肌肥大操作简单、模型稳定、成本低,已成为大鼠心肌肥大动物模型造模的常用方案之一。但该造模方法存在注射剂量、部位以及诱导时间不统一以至难以复制或评价的缺点。不仅如此,人和动物实验研究均已证实,心肌肥大发生存在明显的性别差异[13-14]。为探讨不同剂量以及性别因素对大鼠心肌肥大模型建立的影响,本研究通过采用皮下注射不同剂量ISO(5 mg/kg和1.25 mg/kg)的方法同时诱导建立雌性和雄性SD大鼠心肌肥大模型。结果发现,两种剂量ISO处理后,雌、雄大鼠心脏均呈现不同程度的病理性肥大,但雄性大鼠多个心肌肥大指标变化呈现明显的剂量依赖关系,并且高剂量组雄性大鼠存活率高些。雌性大鼠心肌肥大指标变化对剂量依赖关系不如雄性,并且低剂量组雌性大鼠存活率高于高剂量组。

目前有关多因素影响动物心肌肥大模型建立的报道较少。王晓燕等[15]研究了ISO注射剂量和时间对雄性Wistar大鼠心力衰竭模型的影响,发现高剂量ISO(10 mg/kg)注射对大鼠心脏功能损伤指标和存活率影响优于中、低剂量(5 mg/kg和2.5 mg/kg)。虽然结果和本研究中剂量因素对雄性大鼠的影响有相似的地方,但不同之处是他们只研究了单一性别的雄性大鼠,并且ISO处理时间不一样,主要是因为他们研究的是心力衰竭而非心肌肥大模型。最近,朱竟赫等[16]也采用皮下注射不同剂量ISO的方法建立雄性小鼠慢性心肌缺血模型,结果发现高剂量ISO(32 mg/kg)注射对小鼠心肌缺血指标的影响优于中、低剂量(16 mg/kg和8 mg/kg),并且死亡率低,这和我们的部分结果部分一致。

我们的结果还发现,不同剂量条件下ISO诱发的雌性和雄性大鼠心肌肥大发病存在明显差异。例如,高剂量组雌性大鼠LVW/BW、LVESP和ANP mRAN表达水平低于同剂量雄性大鼠,这种差异在低剂量时较小。有关大、小鼠心肌肥大模型性别差异的研究前期已有报道。例如,在压力负荷诱导的SD大鼠心肌肥大模型中,雌鼠具有更高的心室壁厚度和心肌细胞直径,但心肌纤维化程度却低于雄鼠[17]。但在自发性高血压SHR大鼠模型中,雄鼠比雌鼠具有更严重的左心室肥大以及心肌纤维化[18]。不仅如此,皮下注射ISO(10 mg/kg)引起的心脏重塑在不同性别小鼠间也存在差异,雌性小鼠心室壁厚度、心肌面积和胶原蛋白沉积增加的程度小于雄性小鼠,但血压、心率和心功能指标之间性别差异不大[19]。上述研究结果表明,性别因素对大、小鼠心肌肥大模型都有重要影响,不过这些研究和本文发现的高剂量时雄性大鼠左心室相对重量显著高于雌性大鼠,但心肌细胞面积和纤维化程度之间没有明显差异的结果不太一致,导致这种差异的原因比较复杂,可能和造模方法、时间以及品种、品系不同有关。

图7 大鼠心肌组织Masson染色Note.A,Masson staining of rat myocardial tissue.B,Partially enlarged view of Figure A at the arrow.Figure 7 Masson staining of rat myocardial tissue

综上所述,本研究通过比较不同剂量和性别因素对ISO诱导的大鼠心肌肥大模型建立的影响,发现ISO注射剂量高低对雄性大鼠心肌肥大程度影响较大,并且雄性大鼠高剂量组存活率高于低剂量组。虽然剂量因素对雌性大鼠模型肥大程度影响不明显,但雌性低剂量组存活率较高。所以在进行ISO诱导建立大鼠心肌肥大模型时,可根据具体实验设计和动物性别预期选择性的采用两个不同注射剂量。