后天继发性免疫低下动物模型研究及在中医证候模型的应用进展

刘美怡钱深思容蓉杨勇∗

(1.山东中医药大学,济南 250355;2.山东中医药大学,中医药抗病毒协同创新中心,济南 250355)

免疫力是指机体在生存发展过程中所形成的识别“自我”与“非己”,并排斥“非己”而保护“自我”的能力,即机体自身的防御机制。免疫力低下包括因长期生活作息不规律或某些原发疾病等所致的机体免疫功能下降,还包括老年人的免疫系统功能性衰退而表现出的免疫低下状态。当免疫机能下降,机体容易处于亚健康状态,更容易受到致病因子的侵袭,因此,建立能反映免疫低下特点并可重复、稳定的动物模型将对开展相关疾病的防控具有十分重要意义。本综述主要介绍免疫低下模型的实验动物、建模方法、评价指标及其在中医证候模型中的应用,为今后选择合适的免疫低下动物模型开展疾病发病机制、药物评价等研究提供参考。

1 免疫低下动物模型分类

免疫低下模型动物按照获得方式不同可分为先天性免疫低下和后天继发性免疫低下,前者为先天遗传性缺陷病所致,后者则主要是由恶性肿瘤、病毒、药物、营养不良等所致。

1.1 先天性免疫低下动物模型

先天遗传性免疫损伤常见于以下模型:BALB/c-nu、C3H-nu、C57BL/6-nu、NIH-nu品系裸鼠以及La-sat品系等,是先天缺失一种或两种免疫器官的模型动物;CBA/N、Beige、SCID及B-NSG品系等,是各类免疫细胞存在缺陷的小鼠模型;裸大鼠;SHR品系大鼠;还有C8αt-r缺损症、C4缺损症、C5缺损症及C6缺损症等补体缺损的免疫功能障碍动物模型[1]。这些模型动物普遍个体差异小,动物用量少,且由于多是基因改变,免疫学特性比较稳定,免疫缺陷维持时间较长;但缺点是由于先天免疫低下,有些品系小鼠生命周期仅维持在8.5个月左右,不利于长期跟踪实验,繁殖力差,且价格大多昂贵,不利于广泛开展使用。

1.2 后天继发性免疫低下动物模型

模型建立多用小鼠、大鼠、家兔、雪貂、比格犬等动物。目前常采用物理、化学及辐射的方法建立免疫低下动物模型,虽然此法造成的免疫损伤是暂时的,但在可获得性和经济性上,比先天免疫缺陷动物模型更具可操作性优势,本文将对此进行重点阐述。

2 后天继发性免疫低下动物模型的建立及评价

2.1 强电刺激法

电刺激法多选用大鼠,给予10 min的足底电击刺激(电流强度1.0 mA,共33次,时间间隔为15 s,每次持续3 s),进行为期14 d的造模。足底电击可使其免疫受到抑制,IgG抗体水平降低[2]。此方法危险系数较高且不易操作,因此,现少有研究采用强电刺激法建立免疫低下动物模型。

2.2 辐射法

此法多采取3-6 Gy剂量的射线全身均匀照射小鼠或大鼠24 h来实现,应用最多的是60Co-γ射线和X射线。杨芳等[3]提供的方法为:40 cm×40 cm的照射视野,5 Gy剂量的X射线进行一次性全身照射,源皮距为100 cm。辐射法所致免疫低下模型多表现为体重下降、活动减少,脾和胸腺萎缩,T淋巴细胞亚群值改变[4],白细胞和淋巴细胞计数减少等[5]。张蓉等[6]认为辐射是一种毒邪,火热炽盛易耗气伤阴而气血亏虚,现也有不少人采用辐射法制备动物模型来研究中医证候。郭平等[7]用60Co-γ射线建立血虚证小鼠模型,免疫学指标降低的同时,也出现了血虚证的表现。辐射法致免疫低下动物模型多应用于中医药抗辐射作用研究及保健食品对辐射损伤的辅助保护和免疫调节作用研究。此法对实验室的要求较高,并且通过辐射法造模的动物生命周期会缩短[8],不适用于周期较长的实验研究。

2.3 应激法

应激所致的肝郁脾虚可使正常免疫功能受阻,由此将应激法用于构建免疫低下模型。马涛等[9]对Wistar大鼠施加束缚夹尾5 min、噪声12 h、禁食禁水12 h等不可预见性刺激,进行56 d实验,通过慢性应激建立肝郁脾虚抑郁模型,发现大鼠出现了炎症反应,细胞因子IL-1β含量增加,IFN-γ、IL-2等则减少,脾细胞免疫功能受损。黄晓峰等[10]每天从17:00-9:00将C57BL/6小鼠(6～8周龄,雌性)置于锥形管中束缚限制其活动,重复5 d,通过慢性心理应激也能抑制免疫功能。

2.4 手术切除法

手术切除法是指通过切除免疫器官来实现免疫低下,如脾切除模型的建立,方法如下:选择6周龄雄性大鼠,麻醉备皮,沿左上腹旁正中进腹剪开1.5～2.0 cm大小的切口,结扎血管和脾蒂,摘除脾后缝合切口。术后免疫细胞活性减弱,CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均下降[11]。脾切除所致免疫低下状态维持时间较长,适用范围较广。

2.5 免疫抑制剂法

2.5.1 环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)

CTX腹腔注射是常用的免疫低下动物模型诱导方法。ICR小鼠、BALB/c小鼠、昆明小鼠、A/J小鼠、豚鼠和大鼠是常用的啮齿类模型动物,此外还有家兔等哺乳类动物。CTX给药剂量和时间是有效建立免疫低下模型重要的因素,文献报道没有统一的给药剂量和时间标准。相比较之下,小鼠模型多为80 mg/kg连续3 d和40 mg/kg连续10 d腹腔注射给药。有学者对比研究不同剂量CTX对SD大鼠的造模效果,通过综合存活率和白细胞计数两项指标得出:中剂量组(间隔3 d,第1天150 mg/kg,第4天100 mg/kg)是最佳的诱导剂量[12]。吴萌等[13]采用4个月兔龄的新西兰大耳家兔,CTX剂量为28.75 mg/(kg·d),连续注射10 d,胸腺和脾指数明显降低。

CTX建模后,动物的体重、精神状况和自主活动量等表观指标可初步反映动物的免疫功能状况。进一步检测发现,脾和胸腺指数降低、白细胞减少、IL-2、IL-4等细胞因子含量下降、IgG、IgM血清抗体水平下降、脾淋巴细胞增殖能力下降、巨噬细胞吞噬功能减弱、CD4+和CD8+及其比值均下降[14-15]。碳廓清实验是评估免疫水平的方法之一,尾静脉注射墨水是碳廓清实验最常用的方式,王红梅等[16]还推荐了内眦静脉注射墨水的方法。

近些年来,CTX广泛应用于中药复方和成分免疫调节作用研究的前期模型构建,其引起的免疫抑制还可用于构建中医脾虚证[17]和血虚证[18]模型。

2.5.2 氢化可的松(hydrocortisone,HY)

HY可减弱免疫功能,SD大鼠或小鼠常作为此类方法的模型动物[19]。通常采用25 mg/(kg·d)的剂量,连续7 d皮下注射HY来建模。HY溶液一般现用现配,采用无水乙醇和生理盐水(1∶5)溶解稀释[20]。吕颖坚等[21]证实造模后小鼠NK细胞活性降低、巨噬细胞吞噬能力减弱,整体免疫水平降低。血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、小肠SIgA、IgG及补体C3的含量也可用于评价HY是否造模成功[20]。

钱宏梁等[22]配置0.0375 mg/mL浓度的HY水溶液于饮水瓶供小鼠饮用,连续14 d,建立虚证小鼠模型。研究认为HY诱导的多是与脾、肾二脏有关的虚证[23-24],潘志强等[23]认为HY用于构建虚证动物模型时,较之其构建免疫低下模型,应稍减给药剂量和延长造模时间。

2.5.3 环孢素A(ciclosporin A,CsA)

CsA能有效抑制辅助性T淋巴细胞活性,抑制CD4+T细胞增殖,可用于构建T细胞功能障碍免疫低下模型。夏琦等[25]采用0.2 mg/g剂量的CsA溶液,连续5 d腹腔注射,建立免疫低下小鼠模型。另有文献报道了连续7 d注射30 mg/(kg·d)剂量CsA的可行方法[26]。由于艾滋病毒主要攻击CD4+T细胞,所以环孢素A也用于免疫缺陷型动物模型的建立,且研究表明中剂量25 mg/(kg·d)为造模最佳剂量[27]。此法一般采用小鼠作为模型动物,灌胃、腹腔注射及肌内注射这三种给药途径均能建立起免疫低下动物模型[26]。

2.5.4 其他免疫抑制剂

国外学者采用醋酸可的松(100 mg/kg)对A/J小鼠连续3 d皮下注射的方法[28],以及地塞米松处理BALB/c小鼠的方法[29],都成功建立了免疫低下模型。也有比格犬模型的报道,通过连续7 d口服泼尼松龙(3.0 mg/kg)建立免疫低下模型[30]。另有研究者将雪貂设做研究对象,采用口服免疫抑制剂混合物(20 mg/kg霉酚酸酯,0.5 mg/kg他克莫司和8 mg/kg泼尼松龙)的方法建模[31-32]。由于雪貂呼吸道的受体分布和人类十分相似,且会出现和人一样的打喷嚏、流鼻涕等表现,这些是其他模型动物所不具备的特点,被普遍认为是研究流感病毒的优良模型。

2.6 其他药物方法

2.6.1 腺嘌呤

腺嘌呤可用于构建肾虚且免疫低下大鼠模型,需提前用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液助悬,配置成1.5%的腺嘌呤混悬液,SD大鼠经连续56 d灌胃腺嘌呤悬液(150 mg/kg)后,NK细胞活性降低、肾形态异常、补体C3水平下降,脾淋巴细胞也受到影响[33]。李卓恒等[34]通过腺嘌呤成功复制了肾虚大鼠模型,用于肾精亏虚证和肾虚生殖功能损伤的研究。免疫低下与中医肾虚证相关联,因此可通过建立免疫低下动物模型来研究中医肾虚证,但腺嘌呤致肾虚证造模时间稍长。

2.6.2 利血平

利血平最初用于中医脾虚证、肝郁脾虚证的建模,但其会造成模型动物肠道吸收功能受阻,蛋白质合成不足,机体免疫功能下降,因此可用来构建免疫低下模型。可通过对小鼠进行连续17 d的背部皮下注射利血平(10-4g/kg)来建模[35]。研究表明腹腔注射利血平(4 mg/kg)可成功建立大鼠抑郁模型,悬尾实验、强迫游泳实验、旷场实验等可作为评价造模是否成功的判断依据。造模后,胸腺和脾指数下降,炎性因子IL-1β和TNF-α水平升高[36],利血平所致脾虚证可进一步用于构建免疫低下模型。

2.6.3 D-半乳糖(D-galactose,D-gal)

D-gal常作为致衰剂用于构建衰老模型[37-38],但机体的衰老机制与免疫功能的变化息息相关[39],也有少数人采用D-gal致衰来间接构建免疫低下模型。方法主要有两种:小鼠采用125 mg/kg的剂量颈背部注射,连续45 d[40];大鼠采用350 mg/kg的剂量颈背部注射,连续42 d[41]。研究证实其可用于阳虚证和衰老肾虚模型的制备[41-42]。此法造模周期较长,文献报道在6～8周左右。

3 免疫低下动物模型与中医证候模型的关系

中医证候模型是研究疾病发生发展及中医药作用机制的有效工具,是中医药现代化发展的重要环节。中医证候模型的建立无论是采用疾病模型、病因模型、病证结合模型等都与现代医学的动物模型评价紧密相关。已有研究证实,肝郁证、脾虚证、肝郁脾虚证和肾阳虚证候与现代医学的免疫低下有一定关系,都不同程度地抑制了机体免疫[43-46]。现将免疫低下模型和中医证候模型相关联,主要包括:肾虚证、肝郁脾虚证、血虚证等(表1,2)。

4 讨论

目前国内外建立免疫低下动物模型的方法有很多,各有优缺点。但无论采用何种方法建模,都很难保证实验中能同时抑制模型动物的所有免疫学指标,仅能保证选择合适的方法、药物、剂量和时间点,来影响模型动物的部分免疫学指标[48]。常用到的动物有小鼠、大鼠、新西兰大耳家兔及雪貂等,但实验选择中最常见的还是小鼠,这与小鼠在可操作性和经济性上表现出的优势有关。检测指标可包括:模型动物的宏观指标(体重、摄食进水量、自主活动等)、脏器(胸腺、脾)指数、动物存活率、血常规水平、各细胞因子含量与所占比例以及T淋巴细胞亚群值等。这些都是在免疫力低下模型研究中可借鉴和参考的方法。

表1 免疫低下模型与中医证候模型的关联Table 1 Correlation between immunocompromised models and traditional Chinese medicine syndrome models

表2 免疫低下模型在中医证候中的应用Table 2 Application of immunocompromised models in traditional Chinese medicine syndrome models

中医药具有整合调节、扶正祛邪的作用,其多成分、多靶点、多环节的综合治疗能够较好地改善机体亚健康状态,中医药在治疗免疫力低下这类疾病方面具有独特的优势。“免疫力低下”虽然是西医的病名,应用到中医、中药的现代研究就必然要涉及到中医证候的定位及病证结合模型的研究。我们认为可以在以下两个方面找到结合点:一是借鉴中医证候的造模方法,再结合免疫低下造模的手段,综合评价复合模型的中医证候指标及微观免疫学指标;另一方面是以现有的免疫低下造模方法为主体,扩展中医证候的评价指标,以已有成熟的某种免疫低下造模方法来模拟某类中医证候模型的评价模式。这种病证结合模型研究将遵循中医理论指导的基本原则,既符合传统的评价体系,又能结合现代免疫学进展的技术和方法,深入探讨中医药“扶正祛邪”、“正气存内,邪不可干”等普适性治则治法的作用机理及药物干预机制,将能极大地推动中医药的现代化研究进程。因此,我们认为已有免疫低下动物模型的再评价、免疫力低下复合证候模型的研究模式将是今后此类动物模型在中医药领域开展研究的一个重要方向。