姜荷花清迈粉基因组大小测定

毛俐慧，金亮，丁华侨，董青，胡伟，田丹青

(浙江省园林植物与花卉研究所，浙江 杭州 311251)

基因组大小是指生物单倍体基因组的DNA含量，又称DNAC值。基因组大小是生物体的基本生物学属性，同属物种间各异。根据英国邱园网站的数据库(https://cvalues.science.kew.org)，现已有12 273种植物有DNAC值数据，其中包括被子植物10 770种，裸子植物421种，蕨类植物303种，苔藓植物334种，藻类445种。姜荷花(Curcumaalismatifolia)隶属于姜黄属，是一种热带观赏花卉，原产于泰国和印度，因其形态如莲，常作佛教用花。于2000年左右引进中国，在西双版纳、海南等热带地区，以及广东、广西、福建等南亚热带地区适应良好。近些年本课题组在姜荷花种球抗寒、繁殖等方面做了一系列的工作[1-2]，使其在江浙沪甚至长江流域地区的栽培、越冬等技术难题得到解决。目前，姜荷花已经在我国园林、盆栽等方面有广泛应用，其花葶高度适中(40～60 cm)，也是重要的切花。姜黄属植物多数分布在印度和泰国，两地分别都有40种以上，鉴于还没有系统的分类修订，该属总种数还不十分清楚，估计有100种左右主要分布于南亚、东南亚，少数在中国、澳大利亚、南太平洋地区[3]。姜黄属植物许多物种都具有较高经济、药用、观赏价值，最被熟知的姜黄(C.longaL.)是重要的香料，也可做药用，具有抗癌、抗炎、降血脂等功效。姜黄属已有33种植物具有基因组大小数据，该属植物基因组大小介于0.83 pg(Curcumavamana)与2.38 pg(Curcumaoligantha)[4]，然而姜荷花作为新兴的重要观赏花卉，基因组大小还未知。

流式细胞术是进行快速定量分析分选单个细胞液体流的技术[5]。利用荧光染料对细胞核内DNA进行染色，检测核DNA含量，分析植物倍性，目前已经得到广泛应用[6-8]。本研究拟测定姜荷花的基因组大小，为基因组学研究、倍性育种研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

姜荷花清迈粉的幼苗种植于浙江省园林植物与花卉研究所大棚，摘取新鲜嫩叶作为实验材料。参考标准为萝卜Saxa(RaphanussativusL.Saxa)，来自捷克科学院实验植物研究所，其基因组大小为2C=1.11 gp，1C=543 Mbp。该材料种植于浙江省园林植物与花卉研究所光照培养间，摘取新鲜嫩叶作为标准植株的实验材料。

1.2 方法

1.2.1 姜荷花细胞核悬液的制备与DNA染色

采用CyStain PI Absolute P(Sysmex-Partec，05-5022)试剂盒提取细胞核并染色。取少量姜荷花清迈粉新鲜嫩叶，蒸馏水清洗，滤纸擦拭，将叶片放入加有0.5 mL裂解液的培养皿中，用双面刀片快速切碎叶片，静置5 min，用30 μm过滤器过滤获得细胞核悬液。在制备好的细胞核悬液中加入染色液(含PI，RNase)，避光染色5 min。采用同样方法制备萝卜细胞核悬液。

1.2.2 上机检测与数据分析

采用CyFlow Ploidy Analyser(德国Sysmex-Partec)流式细胞仪进行基因组大小分析。该机配备532 nm绿色激光器。每个样品检测细胞核数至少为5 000个。检测所得数据用ModFit LT(美国Verity Software House公司)软件进行分析。先检测萝卜细胞核悬液样本，再检测姜荷花、萝卜数量比1∶1混合细胞核悬液。姜荷花的基因组大小计算公式为：姜荷花C值=(姜荷花峰的荧光强度均值/萝卜Saxa峰的荧光强度均值)×萝卜Saxa的C值。

2 结果与分析

流式细胞仪测定结果见图1，通过比较G0/G1期的峰值，可得出姜荷花基因组大小。姜荷花清迈粉的基因组大小是萝卜Saxa的1.84倍，萝卜Saxa基因组大小为543 Mbp，可估算出姜荷花清迈粉的基因组大小约为998.5 Mbp(1C=88.89/48.43×543=998.5 Mbp)，即C值为1.02 pg。图中红色和黄色主峰的峰值分别是萝卜和姜荷花的G0/G1期的峰值。

图1 姜荷花清迈粉基因组流式细胞仪分析 检测结果

3 讨论

基因组大小是生物体重要的特性参数，研究发现，基因组大小与植物对氮水添加的响应、对气候的适应，以及植物的入侵性大小都具有相关性。小基因组植物地上净初级生产力(ANPP)对氮水添加响应更敏感，水和氮水共同添加使DNAC值小的植物ANPP显著增加[9]。对单子叶植物核DNA含量与气候的适应性分析表明，在中等温度和雨量环境下，核DNA含量最高，温度和水分趋向极端的环境下其核DNA含量较低[10]。入侵植物常具有更小的DNAC值，统计的47种入侵杂草的DNAC值平均为1.76 pg，极显著小于非杂草性草本植物(6.75 pg)[11]。

不同物种植物的基因组大小不同，对25种鸢尾属植物的流式细胞仪测定表明，该属基因组大小为2.62～6.77 pg[12]。依据邱园网站提供的资料，姜黄属植物的DNAC值为0.83～2.38 pg。有研究综述前人的研究结果表明，植物种内甚至存在基因组大小的变异，这些变异通常和生态功能的分化相关，纬度、海拔、营养条件、光照等可能会对基因组大小产生一定的影响[13]。本研究仅测定了单一地理来源的姜荷花清迈粉的基因组大小，对姜荷花的基因组大小尚没有全面的认识，后续研究可以对姜荷花不同品种，以及同个品种不同群体的样本进行基因组大小测定，从而对姜荷花基因组大小有更全面的了解。

本研究用流式细胞仪，丰富了姜荷花的生物学特征资料，为姜荷花基因组测序提供了必要的参考数据，也为倍性育种结果检测提供了参考依据。同时为姜科其他物种的基因组大小测定提供技术和方法上的参考。