阿尔茨海默病引起的轻度认知功能损害的微小RNA 表达谱的生物信息学分析

何海宁，张 微，严 峰，史琰琛，王静华，肖世富，王 涛

上海交通大学医学院附属精神卫生中心老年精神科，上海交通大学阿尔茨海默病诊治中心，上海 200030

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种常见的老年疾病，随着我国老龄化进程的加速，由该病带来的医疗护理和经济负担问题将日益严峻。AD 的主要病理特征为脑内β 淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积和神经纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）[1]。然而近10 年来，针对上述病理机制开发的药物Ⅲ期临床试验均纷纷宣告失败，包括Aβ 单克隆抗体[2-3]、tau 蛋白拮抗剂[4]、β/γ-分泌酶抑制剂[5-6]等，这提示我们需要进一步研究AD 的病理机制以制定有效的干预策略。研究[7-9]显示，AD 的认知衰退过程是一个疾病连续谱，AD 所致轻度认知功能损害（mild cognitive impairment，MCI）期（MCI due to AD）是AD 所致痴呆（dementia due to AD）的前驱期，也是早期干预的最佳切入点。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类小分子单链非编码RNA，可在转录后水平调控基因表达[10]。在神经元中特异表达的miRNA 是促进神经元生长发育、分化成熟和保持突触功能的关键因子，对维持神经稳态发挥了重要作用[11-12]。既往研究[13-14]表明，AD 患者体内的某些特定miRNA 可通过调节相关基因[如淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、淀 粉 样 前 体 蛋 白β 位 点 裂 解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）等]参与AD 的病理过程，这可能是AD 的发病机制之一。目前，大部分研究都仅针对AD 患者，鲜少有针对AD 的前驱期——AD 所致MCI 患者的报道。而在疾病早期开展相关miRNA 的表达及其调控机制的研究，将有助于深入了解AD 的早期发病机制，亦可为其早期药物的开发提供理论依据。

基于此，本研究通过对受试者的外周血血浆行miRNA 芯片测序，分析筛选出在AD 所致MCI 组血浆中显著上调的miRNA，并对miRNA 的预测靶基因进行生物信息学分析，以探究miRNA 在AD 早期病理过程中的 作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象及其资料收集

本研究的纳入对象筛选自中国纵向老龄化队列研究（China Longitudinal Aging Study，CLAS）数据库。CLAS的临床研究注册号为NCT03672448，该研究经上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会批准，并获得了所有受试者和/或其法定监护人的书面知情同意。

本研究共纳入10 例研究对象，其中AD 所致MCI 患者5 例（AD 所致MCI 组），认知功能正常老人5 名（对照组）。AD 所致MCI 组入组标准：①年龄60 ～90 岁。②符合2011 年美国国立衰老研究所和阿尔茨海默病协会（National Institute Aging and Alzheimer's Association，NIA-AA）修订指南中“AD 所致MCI-中度可能”的诊断标准[9]。③18F-Flumetamol 正电子发射计算机断层扫描（positron emission tomography，PET）检测Aβ 阳性。排除标准：①躯体疾病、酒精、药物或理化因素所致的认知功能损害。②存在重性精神疾病或严重躯体疾病。③存在严重视力、听力障碍，不能配合完成认知功能评估。对照组入组标准：①年龄60 ～90 岁。②认知功能正常。排除标准：①存在重性精神疾病或严重躯体疾病。②存在严重视力、听力障碍，不能配合完成认知功能评估。

收集所有受试者的人口学基本资料，包括性别、年龄和受教育年限，并采用蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）对患者的认知功能进行 评估。

1.2 样本收集及RNA 提取

每位受试者空腹12 h 后，采集其静脉血于EDTA 抗凝管中，4 ℃、1 207×g离心20 min 后，收集上层血浆。使用TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）提取血浆RNA，具体操作步骤按照说明书进行。随后，使用NanoDrop 1000（Thermo Fisher，美国）测定RNA 纯度，吸光度比值 [D（260 nm） /D（280 nm）]在1.8 ～2.1 之间即为纯度达标。

1.3 miRNA 芯片测序及分析

采用miRCURYLNATMmiRNA 芯片（Exiqon 公司，丹麦）探测受试者血浆样本中miRNA 的表达情况，根据使用说明书进行操作。使用Axon GenePix 4000B 芯片扫描仪扫描芯片，GenePix Pro 6.0 读取芯片扫描图像，提取探针的信号值。相同的探针信号值取中值合并，保留所有样本中均≥30.0 的探针值，对全部芯片进行中值标准化。使用独立样本t检验比较AD 所致MCI 组和对照组的组间差异。差异倍数（fold change，FC）的对数（log2FC） ≥ 1 被定义为上调，P＜0.05 为差异具有统计学意义，同时符合这2 个标准的miRNA 即为显著上调miRNA。

本研究采用的芯片含有3 100 种探针，覆盖所有在miRBase 19.0 数据库中注释的人、小鼠和大鼠的miRNA，同时也包括这些物种相关的病毒miRNA。此外，还有25个独有的miRPlus 的人源miRNA 没有被收录在miRBase数据库中。

1.4 miRNA 的靶基因预测

显著上调miRNA 的靶基因采用TargetScan 7.2 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行预测，即通过搜索和miRNA 种子区域相匹配的保守8mer 和7mer 位点来预测其靶基因[15]，并根据cumulative weighted context++ scores 预测靶基因可信度，该分数值越低提示预测可信度 更高。

1.5 miRNA-基因相互作用网络构建和关键miRNA 筛选

miRNA-基因相互作用网络可使多个miRNA 与靶基因的相互作用可视化，寻找调控网络中的关键miRNA 及关键基因。采用Cytoscape 软件构建miRNA-基因相互作用网络，分析miRNA 与靶基因之间的相互作用。靶基因的筛选阈值为cumulative weighted context++ score＜-0.6，删去预测可信度低的靶基因，使最终的网络能更直接地突出关键节点。采用CytoNCA 计算网络中各节点的连接（degree，DC）值，删去DC 值＜2 的基因节点，得到核心网络；以cumulative weighted context++ scores 为加权值，计算DC 值，筛选核心网络中的关键miRNA。

1.6 关键miRNA 靶基因的功能分析

基因本体数据库（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路分析是描述基因生物学功能的常用方法[16]。使用R 语言分析包对核心网络中关键miRNA 的靶基因进行GO 富集分析和KEGG 通路分析，采用Benjamini-Hochberg 方法对多次比较的P值进行校正，以P＜0.01 筛选富集分析条目和通路信息。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对研究数据进行统计分析。符合正态分布的定量资料以±s表示，采用独立样本t检验进行分析；定性资料以频数和百分比表示，采用χ2检验分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者人口学资料及临床资料比较

结果（表1）显示，2 组受试者在年龄、性别、受教育年限及MoCA 评分间差异均无统计学意义。

表1 2 组受试者人口学资料和临床资料比较Tab 1 Comparison of demographic and clinical data between the two group

2.2 血浆miRNA 的表达情况

根据log2FC 和P值筛选显著上调的miRNA，结果（表2）显示，与对照组相比，AD 所致MCI 组的外周血血浆中存在13 个显著上调的miRNA，且均为人源性（hsamiR）。显著上调miRNA 的表达情况如图1。

表2 AD 所致MCI 组患者的外周血血浆中显著上调的miRNATab 2 Significantly up-regulated miRNAs in peripheral blood plasma of MCI due to AD group

图1 AD 所致MCI 组患者的外周血血浆miRNA 的表达情况Fig 1 Expression of miRNAs in peripheral blood plasma of MCI due to AD group

2.3 miRNA-基因相互作用网络及关键miRNA 筛选

miRNA-基因相互作用网络如图2A，其中hsa-miR-550a-3p、hsa-miR-424-3p 独立于调控网络，与其他miRNA无相互作用。移除DC 值＜2 的基因节点和2 个独立的miRNA 节点后得到核心网络，即包括11 个miRNA 和65 个基因节点（图2B）。在核心网络中计算以cumulative weighted context++ scores 加 权 的DC 值，排 在 前5 位 的miRNA 分别为hsa-miR-3202、hsa-miR-4443、hsa-miR-4747-5p、hsa-miR-4722-5p 和hsa-miR-5194。该5 个miRNA 被确定为调控网络中的关键miRNA。DC 值＞2 的基因节点有CCHC 型锌指核酸结合蛋白（CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein，CNBP）、泛素相关修饰物1（ubiquitin related modifier 1，URM1）、序列相似的83 家族 成 员F（family with sequence similarity 83 member F，FAM83F）、跨膜蛋白14（tetraspanin 14，TSPAN14）、视黄素（retbindin，RTBDN）、包含S1 的pleckstrin 同源结构域（pleckstrin homology domain containing S1，PLEKHS1）和argonaute RISC 催 化 组 分2（argonaute RISC catalytic component 2，AGO2），这7 个 关 键 基 因 被2 个 及 以 上miRNA 同时调控。

2.4 关键miRNA 的靶基因GO 富集分析

GO 富集分析结果（图3）显示，hsa-miR-3202 的靶基因主要涉及突触可塑性的调节、Wnt 信号通路、甲基化依赖的基因沉默等生物学过程，hsa-miR-4722-5p 的靶基因主要涉及高尔基体小囊泡的转运过程、多巴胺转运、抗原的加工提呈等生物学过程，hsa-miR-4747-3p 的靶基因主要涉及神经递质运输、突触间囊泡转运、突触间囊泡定位等生物学过程，hsa-miR-5194 的靶基因主要涉及miRNA 前体（pre-miRNA）的翻译、谷氨酸受体信号通路、肌动蛋白纤维聚合、囊泡运输等生物学过程，hsamiR-4443 的靶基因主要涉及I-κB 激酶/NF-κB 通路和调节淋巴细胞、单核细胞增殖等生物学过程。

2.5 关键miRNA 的靶基因KEGG 通路分析

KEGG 通路分析结果（图4）显示：hsa-miR-3202的靶基因主要参与Ras 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路和糖酵解/糖异生等通路，hsa-miR-4722-5p 的靶基因主要参与Ras 信号通路、细胞因子受体信号通路和胰岛素信号通路等，hsa-miR-4747-3p 的靶基因主要参与MAPK 信号通路、糖酵解/糖异生、嘌呤代谢等通路，hsa-miR-5194的靶基因主要参与低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、趋化因子信号通路和细胞内吞作用等通路，hsa-miR-4443 的靶基因主要参与Ras 信号通路、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、果糖/甘露糖代谢等 通路。

图2 miRNA-基因相互作用网络Fig 2 miRNA-target gene interaction network

图3 关键miRNA 的靶基因GO 富集分析Figure 3 GO enrichment analyses of target genes of key miRNAs

图 4 关键miRNA 的靶基因KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analyses of target genes of key miRNAs

3 讨论

目前，AD 的生物标志物主要分为脑脊液相关蛋白标志物（Aβ42、Aβ40、总tau 蛋白和磷酸化tau 蛋白）和神经影像学检测到的相关标志物（Aβ PET、结构磁共振成像显示的脑萎缩）[17-18]。其中，腰椎穿刺获取脑脊液样本为有创操作，神经影像学检查费用较为昂贵，无法大规模应用于临床。然而目前，血液样本的获取相对简便，且为无创或微创操作，较适用于AD 的早期筛查和诊断。本研究针对AD 所致MCI 患者的血浆miRNA 进行芯片测序及生物信息学分析，发现有13 个显著上调的miRNA，其中5 个关键miRNA 参与了AD 的早期病理过程，或可作为早期诊断AD 所致MCI 的潜在生物标志物。同时，本研究纳入的AD 所致MCI 患者均经18F-Fluementamol PET 金标准确诊，提升了临床诊断的可靠性[9]。但上述miRNA的血浆表达水平尚需进一步验证，将其作为生物标志物用于诊断AD 所致MCI 的诊断效力仍需大样本临床研究加以证实。

本研究针对关键miRNA 的靶基因进行GO 富集分析发现，其主要参与突触可塑性的调节、Wnt 信号通路、突触间囊泡转运、突触间囊泡定位等生物学过程。突触损伤是AD 疾病过程的早期事件，即在早期AD 患者和MCI 患者的大脑新皮层和海马中均存在突触连接丧失和突触数量减少的情况[19-20]。海马是记忆形成的关键脑区，海马中的突触损伤与认知能力下降密切相关。因此，我们推测hsamiR-3202 和hsa-miR-4747-3p 可能通过抑制突触可塑性的调节、突触间囊泡转运和囊泡定位等生物学过程造成突触损伤，进而引起AD 的发生。Wnt 信号通路主要参与细胞增殖、细胞凋亡、轴突导向、突触形成和神经细胞再生等生物学过程[21-22]。近年来研究[23-24]发现，经典的Wnt/β-catenin信号通路广泛参与神经元的增殖、分化、凋亡和突触可塑性调节，在神经退行性疾病中发挥了重要作用。Tapia-Rojas等[25]研究发现，抑制Wnt 信号通路可以诱导海马中Wnt 信号通路成分的改变和功能的丧失，从而引发tau 蛋白磷酸化和Aβ1-42 水平升高，造成APP 转基因小鼠认知下降。因此，本研究结果提示hsa-miR-3202 可能通过抑制Wnt 信号通路，参与AD 早期的病理过程。另外，我们注意到hsamiR-5194 参与调节miRNA 前体的翻译，提示hsa-miR-5194可能参与调控一些AD 相关miRNA 的表达。

KEGG 通路分析发现，关键miRNA 的靶基因主要参与Ras 信号通路、MAPK 信号通路、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、果糖/甘露糖代谢等通路。研究[26-34]显示，Ras 信号通路和MAPK 信号通路在AD 病理过程中起着重要作用。MAPK 是一组能被不同细胞外刺激激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要由细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38-MAPK 共3 条信号转导途径组成。脑内MAPK/ERK 信号通路参与调节神经元的增殖和凋亡，且ERK 信号传导可激活糖原合成激酶-3（glycogen synthesis kinase-3，GSK-3），造成APP和tau 蛋白磷酸化，与AD 的病理机制密切相关[26]。ERK的激活也可造成线粒体形态和功能异常，增强氧化应激反应[27]。而对AD 患者脑组织进行尸检后发现，p38-MAPK在与学习和记忆相关的脑区中高度表达[28]，且其激活的发生是在疾病的早期[29-30]。p38-MAPK 的激活可导致细胞内钙、活性氧产生，线粒体应激增加[31]。且体外研究[32]表明，p38-MAPK 可促进神经细胞凋亡。而Ras 蛋白可作为信号通路的分子开关，调控下游MAPK 信号通路；Ras/MAPK 级联通路可参与海马区CA1、杏仁核、齿状回以及其他涉及学习和记忆的区域中突触可塑性的调节[33]。同时，Ras 信号通路也可直接参与神经元生长发育过程，促进皮层神经元之间的突触形成[34]。因此，针对本研究预测的上调miRNA 在体内的调控网络和潜在的调控机制，我们推测该miRNA 可能通过调节这些相关的通路参与AD的发病过程。

总之，本研究首次提出了AD 所致MCI 患者的血浆中存在hsa-miR-3202 等13 种上调miRNA，其或可作为潜在的生物标志物用于对AD 所致MCI 的诊断研究；同时，本研究还发现，在miRNA-基因的调控网络中存在5 个关键miRNA，其上调可能是AD 发生的重要因素。通过调控相关通路影响AD 的发生与发展，对AD 治疗的药物靶点研究和发病机制研究具有重要意义。

参·考·文·献

[1] Ballard C, Gauthier S, Corbett A, et al. Alzheimer's disease[J]. Lancet, 377(9770): 1019-1031.

[2] Doody RS, Thomas RG, Farlow M, et al. Phase 3 trials of solanezumab for mild-to-moderate Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2014, 370(4): 311-321.

[3] Salloway S, Sperling R, Fox NC, et al. Two phase 3 trials of bapineuzumab in mild-to-moderate Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2014, 370(4): 322-333.

[4] Gauthier S, Feldman H, Schneider LS, et al. Efficacy and safety of tauaggregation inhibitor therapy in patients with mild or moderate Alzheimer's disease: a randomised, controlled, double-blind, parallel-arm, phase 3 trial[J]. Lancet, 2016, 388(10062): 2873-2884.

[5] Egan MF, Kost J, Voss T, et al. Randomized trial of verubecestat for prodromal Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2019, 380(15): 1408-1420.

[6] Henley D, Raghavan N, Sperling R, et al. Preliminary results of a trial of atabecestat in preclinical Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 2019, 380(15): 1483-1485.

[7] Sperling RA, Aisen PS, Beckett LA, et al. Toward defining the preclinical stages of Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease[J]. Alzheimer's Dement, 2011, 7(3): 280-292.

[8] McKhann GM, Knopman DS, Chertkow H, et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease[J]. Alzheimers Dement, 2011, 7(3): 263-269.

[9] Albert MS, DeKosky ST, Dickson D, et al. The diagnosis of mild cognitive impairment due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease[J]. Alzheimers Dement, 2011, 7(3): 270-279.

[10] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[11] Schratt G. microRNAs at the synapse[J]. Nat Rev Neurosci, 2009, 10(12): 842-849.

[12] Fiore R, Siegel G, Schratt G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1779(8): 471-478.

[13] Tan L, Yu JT, Hu N, et al. Non-coding RNAs in Alzheimer's disease[J]. Mol Neurobiol, 2013, 47(1): 382-393.

[14] Silvestro S, Bramanti P, Mazzon E. Role of miRNAs in Alzheimer's disease and possible fields of application[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(16): E3979.

[15] Agarwal V, Bell GW, Nam JW, et al. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs[J]. Elife, 2015, 4: E05005.

[16] Ashburner M, Ball CA, Blake JA, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology[J]. Nat Genet, 2000, 25(1): 25-29.

[17] Olsson B, Lautner R, Andreasson U, et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Neurol, 2016, 15(7): 673-684.

[18] Rabinovici GD, Gatsonis C, Apgar C, et al. Association of amyloid positron emission tomography with subsequent change in clinical management among medicare beneficiaries with mild cognitive impairment or dementia[J]. JAMA, 2019, 321(13): 1286-1294.

[19] Scheff SW, Price DA, Schmitt FA, et al. Hippocampal synaptic loss in early Alzheimer's disease and mild cognitive impairment[J]. Neurobiol Aging, 2006, 27(10): 1372-1384.

[20] Scheff SW, Price DA, Schmitt FA, et al. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer disease and mild cognitive impairment[J]. Neurology, 2007, 68(18): 1501-1508.

[21] Salinas PC. Wnt signaling in the vertebrate central nervous system: from axon guidance to synaptic function[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012, 4(2): A008003.

[22] Harrison-Uy SJ, Pleasure SJ. Wnt signaling and forebrain development[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012, 4(7): A008094.

[23] Fortress AM, Frick KM. Hippocampal Wnt signaling: memory regulation and hormone interactions[J]. Neuroscientist, 2016, 22(3): 278-294.

[24] Tiwari SK, Agarwal S, Seth B, et al. Curcumin-loaded nanoparticles potently induce adult neurogenesis and reverse cognitive deficits in Alzheimer's disease modelviacanonical Wnt/β-catenin pathway[J]. ACS Nano, 2014, 8(1): 76-103.

[25] Tapia-Rojas C, Inestrosa NC. Wnt signaling loss accelerates the appearance of neuropathological hallmarks of Alzheimer's disease in J20-APP transgenic and wild-type mice[J]. J Neurochem, 2018, 144(4): 443-465.

[26] Kirouac L, Rajic AJ, Cribbs DH, et al. Activation of Ras-ERK signaling and GSK-3 by amyloid precursor protein and amyloid β facilitates neurodegeneration in Alzheimer's disease[J]. eNeuro, 2017, 4(2). DOI: 10.1523/ENEURO. 0149-16.2017.

[27] Gan XQ, Huang SB, Wu L, et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1842(2): 220-231.

[28] Yasuda S, Sugiura H, Tanaka H, et al. P38 MAP kinase inhibitors as potential therapeutic drugs for neural diseases[J]. Cent Nerv Syst Agents Med Chem, 2011, 11(1): 45-59.

[29] Sun AY, Liu M, Nguyen XV, et al. P38 MAP kinase is activated at early stages in Alzheimer's disease brain[J]. Exp Neurol, 2003, 183(2): 394-405.

[30] Pei JJ, Braak E, Braak H, et al. Localization of active forms of C-Jun kinase (JNK) and p38 kinase in Alzheimer's disease brains at different stages of neurofibrillary degeneration[J]. J Alzheimers Dis, 2001, 3(1): 41-48.

[31] Calkins MJ, Reddy PH. Amyloid β impairs mitochondrial anterograde transport and degenerates synapses in Alzheimer's disease neurons[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1812(4): 507-513.

[32] Chen B, Teng Y, Zhang XG, et al. Metformin alleviated Aβ-induced apoptosisviathe suppression of JNK MAPK signaling pathway in cultured hippocampal neurons[J]. Biomed Res Int, 2016, 2016: 1421430.

[33] Selcher JC, Weeber EJ, Christian J, et al. A role for ERK MAP kinase in physiologic temporal integration in hippocampal area CA1[J]. Learn Mem, 2003, 10(1): 26-39.

[34] Kim IJ, Drahushuk KM, Kim WY, et al. Extracellular signal-regulated kinases regulate dendritic growth in rat sympathetic neurons[J]. J Neurosci, 2004, 24(13): 3304-3312.