五大连池东焦得布山硫氧化细菌多样性及其与环境因子的关系

杨磊，张爽，刘涛，晏磊

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

硫氧化过程是硫元素生物地球化学循环中重要组成部分，其中微生物驱动的硫氧化过程起着极其重要的作用，常由硫氧化细菌（sulfur-oxidizing bacteria，SOB）催化[1]。SOB是指能够将低价态的还原性硫化物或单质硫完全氧化为硫酸盐（SO42-）或部分氧化为更高价态的硫化物的细菌类群。基于16SrRNA基因研究发现，海洋、热液口、冷泉、土壤、河流和湖泊等多种环境存在大量硫氧化细菌，比如硫杆菌属、硫微螺菌属和硫化叶菌属等[2]。目前研究已发现大量的SOB的存在，研究较为深入的SOB主要集中在4类：绿硫细菌、紫硫细菌、紫色非硫细菌和无色硫细菌。绿硫细菌中主要包括 Chlorobaculum、Chlorobium、Chloroherpeton和Prosthecochloris等属的菌株；紫硫细菌中主要包括 Chromatiaceae科和Ectothiorhodospiraceae科的菌株；紫色非硫细菌主要包括Rhodospirillaceae、Acetobacteraceae、Rhodobacteraceae、Bradyrhizobiaceae和Hyphomicrobiaceae等科的菌株；无色硫细菌主要包括Paracoccus、Thiobac-illus、Acidithiobacillus、Thiomicrospira 和 Thioalkalimicrobium等属的菌株[3]。目前对SOB多样性研究多还采用可培养方法对其进行富集或分离纯化并采用16S rDNA/16S rRNA进行测序或其他分子技术来得到SOB多样性信息，但这些方法用来研究SOB多样性存在一定局限性。由于SOB的硫氧化过程是由一系列的酶催化完成，其中soxB基因编码的硫代硫酸盐水解酶就是最为关键的酶之一，且目前功能基因在对特殊功能微生物群落（如SOB）多样性分析方面具有较大优势。因此，已有一些研究以soxB用作标记基因应用于研究各种自然环境中的SOB多样性[4-5]。因此，借助功能基因（如soxB基因）分析方法将有助于进一步加深认识对火山环境SOB群落多样性及其响应环境因子的变化。

火山环境是典型的陆地热、酸性极端环境，高温低氧的火山环境与地球初期环境极为相近，有着丰富的生物地球化学循环（如硫循环）。因此，研究火山微生物生态及其参与的元素循环过程，对于探究地球早期生命具有重要作用[6]。另外，火山环境存在着多种形态的硫化物，可为SOB生长和新陈代谢提供能量。但是目前国内外对火山环境中SOB多样性的研究多还是对火山温泉中SOB多样性的调查，对火山环境土壤中SOB多样性的研究少有报道[7]。目前，已有大量文章表明微生物群落的组成和多样性受到环境理化性质的驱动，如温度、pH、总碳、总氮、一些营养物质等[8-10]。五大连池位于黑龙江省西北部，地处小兴安岭山地向松嫩平原过渡的地带，属寒温带大陆性季风气候，总面积约为1 060 km2，是中国著名的第四纪火山群[11-12]。东焦得布山是黑龙江五大连池火山中14座中的一座，分属于东组，故名东焦得布山组。东焦得布山爆发于70～88万年之间，海拔532 m，相对高度101.9 m，该山主要由一些玄武岩及多层火山灰组成，其为典型的截头圆锥丘，倾斜平均30°[13]。

基于以上，实验研究拟以五大连池东焦得布山中SOB为研究对象，通过高通量测序、火山土壤物理化因子得出：（1）分析东焦得布山火山土壤中SOB群落结构；（2）研究东焦得布山土壤中环境因子同SOB的相关性。这些问题的解决为研究东焦得布山土壤中SOB的分布特征，从微生物生态学角度揭示不同环境因素对SOB群落的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

硫酸亚铁铵；37%盐酸；98%硫酸；乙酸钠；冰乙酸；盐酸羟胺；林菲洛琳；氢氧化钠；高氯酸；邻二氮菲；无水乙醇；硫酸高铁铵；磺基水杨酸；硝酸钾；铁粉；二硫化碳；引物710F、1184R（上海生物工程有限公司）；硫化物测定试剂盒（杭州陆恒生物科技有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物科技有限公司）；dd H2O；琼脂糖；DNA提取试剂盒（MP Biomedicals，Santa Ana，美国）。

1.1.2 仪器

氧化还原测试仪（PHB-4，上海仪电科学仪器股份有限公司）；分光光度计（A003，上海菁华科技仪器有限公司）；电泳仪（YJ300C，北京君意东方电泳设备有限公司）；碳氮元素分析仪（mulyi N/2000型，耶拿，德国）；PCR 仪（2720型，Applied Biosystems，美国）；Miseq系统（2500型，Illumina，英国）。

1.2 方法

1.2.1 采样点的设置和样品的采集

东焦得布山位于中国黑龙江省北部的五大连池火山区域（N 44°22′52.043″，E 126°17′29.213″），爆发于70～88万年前，高出地面106.9 m，海拔532 m，相对高度101.9 m。我们于2017年10月（秋季）对五大连池火山东焦得布山火山土壤进行了采样。在东焦得布山火山取3个不同坡度（上中下）的位置作为大采样位点，每个大采样点由同一经纬度的5个小采样位点等比例混合组成，混合后的样品装入经过灭菌处理的采样瓶中。物理化学参数的样品分析储存在4℃，分子生物学分析的样品储存在-20℃，所有储存的样品避免阳光直射。

1.2.2 环境因子分析

以25∶1的灭菌水：火山土壤比过滤取上清液，采用带玻璃电极的数字pH计测量沉积物pH值。氧化还原测试仪测量氧化还原电位，Fe2+含量用邻菲罗啉分光光度法测定[14]、TC采用碳氮分析仪进行测定，TON和Nitrate-N含量采用过硫酸钾消解—紫外分光光度法测定[15]、S0含量采用CS2—分光光度法进行测定[16]、S2-含量采用硫化物测定试剂盒进行测定、SO42-采用硫酸根比浊法进行测定[17]。将所有混合样品进行三组重复测定。

1.2.3 东焦得布山SOB多样性分析

东焦得布山火山土壤样品DNA的提取：将火山土壤样品用细菌DNA提取试剂盒直接进行DNA提取，将提取的DNA直接作为PCR模版。采用SOB功能基因soxB进行PCR扩增，其正向引物为710F（5′-ATCGGYCAGGCYTTYCCSTA-3′），反向引物为1184R（5′-MAVGTGCCGTTGAARTTGC-3′），反应体系：12.5 μL 的 2×Taq PCR Master Mix，上下引物各1μL，1μL的DNA模版，用无菌水补至25μL。PCR扩增的条件为：95℃预变性10 min；94℃，40 s、55℃，60 s、72 ℃，55 s，30 个循环；最后 70 ℃延伸 10 min。PCR产物经胶回收纯化，检测其浓度和条带清晰度。检测合格的样品进行高通量测序，扩增硫氧化细菌的soxB功能基因片段，高通量测序工作由派森诺生物科技有限公司完成。

为了计算样品的多样性指数，首先对OTU丰度矩阵中的全体样本在90%的最低测序深度水平，统一进行随机重抽样（即“序列量拉平处理”），从而校正测序深度引起的多样性差异。随后，使用QIIME软件分别对样本计算4种多样性指数（ACE指数，Chao1指数，Shannon指数，Simpson指数）。

1.2.4 东焦得布山SOB多样性同环境因子的关系

运用CANOCO 5.0软件对环境因子进行主成分分析，以及对SOB群落和环境因子之间进行冗余分析。

图1 东焦得布山采样区概况图Fig.1 Sampling area profile of Dongjiaodebu volcano

2 结果与分析

2.1 东焦得布山火山土壤环境因子的测定结果

东焦得布山火山土壤环境因子的测定结果为：pH为7.65，呈中性；其ORP测定结果为49.33 mV；Fe2+含量为 0.11 μg·g-1；TC 含量为 18.50%；TON 含量为 110.67 μg·g-1，Nitrate-N 含量为 497.54 μg·g-1，S0含量为 0.85 mg·g-1、S2-含量为 0.375 mg·g-1、SO42-含量为541.46μg·g-1。利用Canoco 5.0对测定的环境因子进行PCA分析，结果见图2。根据统计分析原理，PCA中累计方差贡献率大于85%时，可以反应系统的差异。在前两轴的累积贡献率为100%，其中第一主轴为91.13%。从环境因子的相关性来说，TON、TC、Fe2+、ORP、S2-互为正相关，TON、TC、Fe2+、ORP、S2-与Nitrate-N、S0、pH、SO42-呈现负相关；S0与 SO42-呈负相关；Nitrate-N、S0、pH 互为正相关。

图2 东焦得布山理化因子PCA分析Fig.2 PCA analysis of the different environmental factors in Dongjiaodebu volcano

2.2 东焦得布山SOB多样性多样性分析

2.2.1 Alpha多样性指数统计

Alpha多样性是指在细菌在一个特定的区域或生态系统中的多样性，它即可以反映物种丰富度也可以反映物种均匀度[18]。Alpha多样性主要与物种种类数目，即丰富度；多样性，群落中个体分配上的均匀性有关。微生物群落的丰富度指数主要指Chao1和ACE指数。群落多样性指数，主要指Shannon和Simpson指数[19]。东焦得布山SOB共获得441个OTU，ACE指数为508.92，Chao1指数为532.15。而群落多样性指数中，Shannon指数为6.68，Simpson指数为0.974 9。

2.2.2 东焦得布山SOB多样性组成

通过对东焦得布山SOB群落组成高通量测序结果分析，得到结果如图3。结果表明，东焦得布山火山SOB共获得441个OTU分布，共包括23个属，其中优势菌属包括：慢生根瘤菌属bradyrhizobium（25.6%）、芽生绿菌属Blastochloris（12.3%）、雷尔氏菌属Ral－stonia（10.3%）、贪铜菌属Cupriavidus（9.3%）、紫色硫细菌Allochromatium（7.5%）、贪噬菌属Variovorax（6.6%）、甲基杆菌属Methylobacterium（5.5%）、固氮弧菌属Azoarcus（4.4%）。其中未鉴定菌属仅占3.9%。东焦得布山SOB高通量测序结果显示所有被测得的菌属均属于变形菌门。

图3 东焦得布山SOB的群落组成（a：门水平；b：属水平）Fig.3 Community composition of SOB in Dongjiaodebu volcano（a.phylum level，b.genus level）

2.3 东焦得布山SOB多样性同环境因子的关系

东焦得布山SOB多样性同环境因子的关系经由RDA分析结果如图3所示。由图可知，Methylibium、Hylemonella、Blastochloris、Thiobacillus、Bradyrhizobum、Ralstonia 和 TN、TC、Fe2+、ORP、S2-呈极显著正相关；Methylobacterium、Methylorubrum与 S0、Nitrate-N、pH呈显著正相关；贪铜菌属Cupriavidus与S2-、ORP、SO42-、pH呈正相关；其中S2-与大多数菌属均呈正相关。综上，SOB中不同菌属对环境因子的响应也存在着较大差异。

图4 东焦得布山SOB多样性与环境因子的RDA分析Fig.4 RDA analysis of SOB diversity and environmental factors in Dongjiaodebu mountain

3 讨论

五大连池火山区的地理位置特殊，地处小兴安岭山地向松嫩平原过渡的地带，同样，其也属于东北寒区地带，这导致火山环境更为特殊，通过对理化因子的测定发现该火山中含有大量的还原性硫化合物，这为SOB的生长提供了能量来源，这与实验室前期对该区火山细菌与硫化物环境因子相关性结果相符合[20]。在TC、TON含量方面，东焦得布山均高于其他火山，其原因可能是其火山年限属于五大连池火山群的第二古老火山，以及其覆盖大面积的火山次生林，从而导致总碳和总有机氮含量偏高，另外，也不排除一些人为因素如旅游、人工种植等的影响[21]；自然界中硫循环与碳氮循环有着紧密联系，部分碳氮硫循环过程中还存在着偶合反应，这与在PCA分析中，TON、TC等与S2-互为正相关的结果相对应。

研究前期对五大连池环境样品研究中，发现并分离出了两株铁硫氧化菌[22-23]，基于此基础，又对五大连池东焦得布山火山土壤中的SOB多样性进行了测定，发现基于soxB功能基因测得的SOB多样性结果是均属于变形菌门，这表明东焦得布山中SOB的主要参与者是属于变形菌门，这与前人研究中如同样基于soxB功能基因测得西藏热泉中SOB多样性结果也以变形菌门为主的结果类似[24]。该地区的优势菌属包括：慢生根瘤菌属bradyrhizobium（25.6%）、芽生绿菌属Blastochloris（12.3%）、雷尔氏菌属Ralstonia（10.3%）、贪铜菌属Cupriavidus（9.3%）、紫色硫细菌Allochromatium（7.5%）、贪噬菌属 Variovorax（6.6%）、甲基杆菌属Methylobacterium（5.5%）、固氮弧菌属A zoarcus（4.4%），这些微生物较多都属于目前研究较为深入的四类的SOB（绿硫细菌、紫硫细菌、紫色非硫细菌和无色硫细菌），例如bradyrhizobium属于紫色非硫细菌，Allochromatium属于紫色硫细菌等[25]。另外还发现了Thiobacillus菌属，其属于硫杆菌属，常见于矿山，为好氧菌，具有较强的氧化硫及产酸能力[26]。

研究通过RDA分析东焦得布山火山土壤中的SOB多样性与外部环境因子的关系，分析结果表明SOB中不同菌属对环境因子的响应也存在着较大差异，其中S2-与大多数菌属均呈正相关，为影响SOB群落多样性重要环境因素，这可以解释为硫化物在环境里是具有代表性的还原性硫化合物，为SOB生长提供能量来源，所以是影响SOB多样性的重要环境因素。除去环境的外部因素，还有其他微生物之间的相互作用的内部因素，同样也是影响微生物群落结构的重要因素。比如，好氧微生物的生命活动对氧气的消耗造成局部的厌氧环境，有利于S2-的形成；微生物对有机物的脱硫作用等。

目前国内外对火山生境的SOB多样性研究还较少，还应考虑火山年限、活动，火山地区的环境气候这些因素的影响来对火山生境的SOB群落多样性特征进行进一步分析。另外，了解SOB种类会有助于全面解析火山生境的硫元素生物地球化学循环，虽然目前已分离出较多的SOB单菌[27]，但火山极端环境的SOB单菌还是少有报道，下一步应考虑对火山环境SOB分离纯化及其硫氧化途径等方面来进一步加深对SOB的认识，这有利于为SOB的应用提供更多理论依据。

4 结论

通过高通量测序分析东焦得布山火山土壤SOB多样性，以及结合东焦得布山火山土壤环境因子测定结果，最终得出：（1）东焦得布山SOB主要由变形菌门组成，基于高通量数据结果表明，东焦得布山火山土壤中具有较丰富的SOB多样性。其中包括慢生根瘤菌属bradyrhizobium（25.6%）、芽生绿菌属Blastochloris（12.3%）、雷尔氏菌属 Ralstonia（10.3%）、贪铜菌属Cupriavidus（9.3%）、紫色硫细菌Allochromatium（7.5%）、贪噬菌属Variovorax（6.6%）、甲基杆菌属Methylobacterium（5.5%）、固氮弧菌属Azoarcus（4.4%）。（2）通过东焦得布山火山土壤SOB多样性同环境因子的关系的RDA图可知，S2-与东焦得布山火山土壤大多数SOB菌属呈正相关，故推测S2-是影响火山土壤SOB多样性的重要环境因素之一。