液相色谱-串联质谱法对有机肥中19种磺胺的测定

张玉换，徐杰，余鹏飞，黄荣博，何晓明，周炜，赵月钧*

(1.绿城农科检测技术有限公司，浙江 杭州 310051；2.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021；3.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 311119)

随着畜禽业规模化养殖的发展，兽药抗生素滥用现象频频发生。畜禽动物体本身对药物的吸收量有限，更多的药物会随其粪便、尿液排出体外，进入环境。随着有机绿色农业的兴起，这种以动物粪便为原料的有机肥在种植业中被广泛使用[1-3]。由于现有的有机肥处理技术有限，往往在售的有机肥无法完全去除或降解原有的兽药残留，这些高含量的有机肥一旦用于农田，会对其土壤造成严重污染。

磺胺类药物是目前较为常见的广谱类药物。目前关于有机肥中磺胺类检测常用的检测仪器为液相色谱串联质谱，最为常见的前处理方法是使用缓冲盐提取，通过超声、固相萃取净化，或者直接使用加速溶剂萃取仪提取净化[1，4-7]。现有方法相对来说操作较为复杂，成本也较高，对于大批量检测性价比不高。本试验旨在研究出更为经济、简捷、快速、准确的检测前处理方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

TSQ Quantum液相色谱-串联质谱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-50型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)；QT-2型旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；色谱纯乙腈和甲醇(美国Merck公司)；试验用水为去离子水；无水硫酸镁、氯化钠、50 μm 60Å C18粉末、40～60 μm丙基乙二胺粉末(PSA)(上海凌峰有限公司)；优级纯甲酸铵和甲酸(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；0.22 μm有机滤膜；19种(磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲噁唑、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、苯甲酰磺胺、磺胺苯吡唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉质量分数均大于99.0%)磺胺标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 方法

称取试样3.00 g于50 mL离心管中，加入10 mL一级水室温浸泡30 min，再加入0.1%甲酸乙腈溶液15 mL，涡旋1 min混匀，超声15 min提取，再加6 g 无水硫酸镁和1.5 g 氯化钠，涡旋30 s，8 000 r·min-1离心3 min。取1 mL上清液并依次加入150 mg无水硫酸镁、100 mg C18、20 mg PSA净化，涡旋30 s，10 000 r·min-1离心3 min。移取500 μL上清液加水定容至1.0 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜，待测。

1.3 色谱质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温40 ℃；进样量5 μL；流速0.20 mL·min-1；洗脱梯度见表1。在此条件下19种磺胺保留时间详见表2。

表1 19种磺胺类药物的液相色谱梯度洗脱条件

1.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子扫描；采集方式为多反应监测(MRM)模式，其定性离子和定量离子的选择及碰撞能量见表2；喷雾电压5 500 V；毛细管温度450 ℃；雾化气、气帘气和碰撞气均为氮气。

表2 19种磺胺保留时间及质谱多重反应监测(MRM)条件

2 结果与分析

2.1 样品前处理提取剂的选择

对于土壤、畜禽粪便等基质中磺胺类药物的测定，目前该药物检测的前处理方法多采用缓冲溶液和有机溶剂混合液提取，以萃取柱净化。相对来说传统的前处理处理时间耗时较长。目前，多篇文献报道采用QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)法测定肌肉、蛋、饲料中的磺胺类残留，主要采用酸化乙腈提取，液相色谱-串联质谱测定[4，8-13]。较为常见的提取试剂有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，因乙腈除蛋白、除糖等杂质效果优于甲醇、乙酸乙酯，且满足液质直接进样的要求，故选乙腈作为主要有机提取试剂。根据相关研究报道[8-9,11]，加入一定量的酸可提高目标物的提取效率。基于此，本方法采用1%甲酸酸化乙腈溶剂为提取试剂。

2.2 样品前处理净化剂的选择

QuEChERS常见采用无水MgSO4、PSA、C18及GCB净化，其中无水MgSO4用于除去提取液中多余的水分，PSA、C18与GCB常用于除色素、除糖等杂质。本文将150 mg无水MgSO4与其他3种净化剂各100 mg相结合，通过观察净化后的状态与回收率，比较不同净化吸附剂的净化效果。由表3可知，150 mg MgSO4+100 mg C18的净化效果最佳，所测化合物回收率范围为86.9%～97.6%；另外2种组合的磺胺噻唑和磺胺二甲噁唑的回收低于80%。因此，选择150 mg无水MgSO4与100 mg C18组合为基础净化剂。

表3 不同吸附剂组合净化条件下有机肥中19种磺胺类药物的回收率

从净化液的颜色上看，用C18净化后的样品溶液仍呈淡黄色透明液体，而用PSA、GCB净化后的样品溶液澄清透明。由此可知，C18的除色素能力弱于PSA、GCB，而PSA与GCB的净化效果较为明显。若只用C18作为净化剂，对于有机肥类基质较为复杂的样品在仪器上会存在较强的基质效应。

从经济的角度考虑，选择PSA与C18结合使用可减少基质干扰。在使用100 mg C18的基础上，考察不同PSA添加量的净化效果，回收率结果详见表4。结果表明，在10～40 mg的PSA添加量与100 mg C18混合，回收率均能满足70%～120%的要求。其中，当PSA的量超过30 mg时，磺胺噻唑和磺胺二甲噁唑的回收率偏低，值小于80%；添加10 mg与20 mg的PSA，样品回收率均在80%以上，考虑20 mg的PSA净化后的去除基质干扰的效果优于10 mg，故本试验净化剂最终选择为150 mg无水MgSO4+100 mg C18+20 mg PSA混合。

表4 加入不同PSA量条件下有机肥中19种磺胺类药物的回收率

2.3 方法标准曲线

取19种混合标准中间液，分别用处理后猪粪、鸡粪、牛粪为原料发酵的空白有机肥过膜后溶液逐级稀释配制浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、50、100和200 μg·L-1的系列标准工作溶液。

LC-MS/MS分析后以定量离子对峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。结果显示，磺胺类药物在0.1～200 μg·L-1范围内线性关系良好，相关系数R2>0.99。

2.4 检出限和定量限的确定

在有机肥中添加19种磺胺类药品，使其在样品中的浓度为20 μg·kg-1，上机后测得定性和定量离子对信噪比(S/N)值，计算后，以S/N值为3的浓度为样品中该方法的检出限，S/N值为10的浓度为该方法的定量限。由此得到磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪的检出限为6 μg·kg-1，定量限为20 μg·kg-1；其他15种磺胺类药物的检出限为3 μg·kg-1，定量限为10 μg·kg-1。

2.5 方法的准确度与精密度验证

选择猪粪源、鸡粪源与牛粪源3种不同来源的有机肥为检测对象，做3因素6水平添加回收试验，计算得到最终的加标回收率及方法的相对标准偏差(RSD)值。由表5可知，用优化后的前处理方法做3种不同来源的有机肥加标回收，回收率均能满足70%～120%的要求，RSD均在15%以内，满足试验方法要求。说明本方法能满足有机肥中19种磺胺类药物含量测定需要。

表5 不同源有机肥三因素六水平添加回收试验

2.6 实际样品检测

为验证方法的适用性，同时对10个不同来源的有机肥进行检测，检出率20%。其中，24.9 μg·kg-1磺胺喹恶啉在1个猪粪源有机肥中有检出，同时该样品还检出磺胺二甲嘧啶和磺胺喹恶啉，但这两种物质的检出浓度低于本方法的定量限；除猪源性样品中有检出外，在鸡源性样品中也检出磺胺二甲嘧啶87.7 μg·kg-1，磺胺间甲氧嘧啶201.5 μg·kg-1。

3 小结

经优化前处理后的液相色谱串联质谱检测有机肥中19种磺胺的方法具有简便、快捷、准确的特点。能大幅度提高有机肥样品的定性定量检测。