噁喹酸在健康和染病石斑鱼体内代谢规律比较

许凯伦，马建忠，胡园，徐汇镔，王芳，郑伊诺，吴越

(浙江省海洋水产养殖研究所，浙江 温州 325005)

哈维氏弧菌是石斑鱼(Epinephelusspp.)养殖过程中主要的致病菌之一，可引起石斑鱼的皮肤溃疡症、突眼症[1-3]，严重影响了养殖效益。在水产养殖中，药物防治仍然是控制哈维氏弧菌最直接有效的手段。噁喹酸作为一种水产专用抗菌类药物，具有广谱、高效、低毒的特点，是水产专用抗菌类药物。已有学者对噁喹酸在大西洋庸鲽(Hippog-lossushippoglossus)、欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)和凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)等[4-6]多种水产品中的代谢规律进行研究。噁喹酸在水产动物中的基础代谢已有较多报道，但多是在健康动物中进行研究，而在患病动物中的临床药代谢研究很少。本文通过构建石斑鱼哈维氏弧菌人工感染模型，比较噁喹酸在健康和感染哈维氏弧菌石斑鱼体内的药代动力学特征，并结合哈维氏弧菌对噁喹酸的体外药敏实验，以期为噁喹酸在水产临床的应用制定科学合理的给药方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验石斑鱼及菌株

健康石斑鱼体重为(500±50)g，于浙江省海洋水产养殖研究所洞头基地养殖，养殖水温为(25±3)℃。随机抽取该基地的石斑鱼进行检测，未发现噁喹酸存在，养殖期间所投喂饲料均不含噁喹酸。

1.2 实验菌株

11株哈维氏弧菌H1～H11，由本单位自温州地区发生病害的养殖海水鱼类、虾类和贝类体内分离保存，均已做过生化鉴定和16S rRNA测序。

1.3 哈维氏弧菌人工感染石斑鱼

石斑鱼的哈维氏弧菌侵染和半致死剂量实验参考林克冰等[7]的方法，将菌株接种于2216E培养基28 ℃培养18～24 h，用无菌生理盐水稀释得到浓度为2×109mL-1的哈维氏弧菌混悬液，备用。将混悬液和生理盐水以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32的比例梯度配制侵染液进行腹腔注射感染，健康组注射无菌生理盐水。本实验设置2次生物学重复，每次重复选取5尾石斑鱼，每尾石斑鱼的注射量为0.3 mL。各处理组石斑鱼连续观察2周，记录死亡情况。

1.4 LD50的测定和细菌分离

LD50的测定参照Reed-Muench[8]的方法，计算公式为：lg LD50=algb+c；a为距离比例，a=(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%死亡率)；b为稀释系数，本实验的稀释系数为2-1；c为高于50%死亡率的最小浓度的对数。选择人工感染后濒死且有典型症状的石斑鱼进行病原菌的分离鉴定，于超净台上用无菌接种环挑发病组织接种于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)上在28 ℃下分离培养12 h，挑取形态、色泽较一致的优势菌落划线进行纯化培养3次。挑取纯化后的单菌落接种于2216E液体培养基中，28 ℃培养过夜，检索《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株生理生化鉴定，所用的生化鉴定试剂购买自广东环凯微生物科技有限公司。

1.5 石斑鱼给药

以LD50哈维氏弧菌混悬液腹腔注射石斑鱼，待鱼体有明显症状时肌肉注射噁喹酸作为感染组，另设健康石斑鱼作为对照组。噁喹酸注射用药液的配制参考梁增辉[9]的方法，称取噁喹酸1.500 g，溶解于0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液，用6 mol·L-1盐酸调节pH至10.5，用0.9%氯化钠水溶液定容至100 mL，配制成终浓度为15 g·L-1的注射用药液，以20 mg·kg-1鱼体重进行肌肉注射给药。

1.6 药动学研究

1.6.1 样本收集

分别取给药后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72和96 h的健康组和感染组石斑鱼各3尾采集尾静脉血于含有1%肝素钠的离心管中，离心分离血浆并于-80 ℃保存备用。

1.6.2 血浆中噁喹酸的测定

血样前处理参考王慧[10]的方法，取样品1 mL于25 mL离心管中，加入乙酸乙酯20 mL，无水硫酸钠1 g，超声提取5 min。3 000 r·min-1离心10 min后，上清液转入50 mL茄形瓶中。于50～55 ℃下旋转蒸发至近干，迅速加入1 mL流动相溶解，再加入1 mL正己烷于漩涡混合器上充分振荡，转入5 mL离心管中，3 000 r·min-1离心5 min，取下层清液，用0.22 μmol·L-1的针式滤器过滤至进样瓶中。用高效液相色谱法测定噁喹酸在各样本中的游离药物浓度，具体色谱条件如下：色谱柱：安捷伦C18；流动相：1%甲酸水溶液-乙腈(70+30)；流速：1.0 mL·min-1；检测器波长：激发波长312 nm，发射波长366 nm;进样量50 μL。

1.6.3 数据处理

健康组和感染组石斑鱼血浆中噁喹酸的药时数据使用药代动力学软件winNonln 5.2.1进行房室模型拟合并计算药动学参数，药时曲线用Excel 2013绘制。

1.7 药敏分析

药敏实验操作参考吴立婷等[11]实验方法，挑取单菌落接种到水解酪蛋白培养基中，于35 ℃振荡培养6～8 h。将新鲜菌液浓度用无菌生理盐水调至1×108～2×108mL-1。按照培养基、药物、菌液的步骤依次加入96孔板中，分别设置128～0.125 mg·L-1的实验组，细菌对照组和空白对照组，35 ℃培养16～20 h，实验质控菌为大肠杆菌ATCC 25922。

2 结果与分析

2.1 LD50测定和新菌株的分离

石斑鱼人工感染哈维氏弧菌H11后，症状为游动缓慢、无力侧卧，体表、鱼鳍有溃疡，下颌充血，死鱼解剖后发现脾脏呈现暗紫色，肝脏肿大充血。最高浓度组石斑鱼在感染后第2天开始出现死亡，到第4天全部死亡；最低浓度感染组石斑鱼在第2天开始表现出发病症状；注射生理盐水的对照组表现正常。石斑鱼死亡率统计结果如表1所示。在1∶2的稀释比例下，石斑鱼累计死亡数为100%，而高于50%死亡率的最小稀释比例为1∶8。计算结果表明，哈维氏弧菌腹腔注射感染对石斑鱼的LD50为1.2×105g-1鱼体重。从感染后的石斑鱼中再次分离到一株优势细菌，其菌落状态及生化鉴定结果为哈维氏弧菌。

表1 注射不同生理盐水稀释比例石斑鱼的死亡率

对感染后的石斑鱼进行致病菌分离鉴定，得到一株优势细菌，在TCBS培养基上呈现为黄色圆形菌落，表面光滑，中心略凸起，革兰氏染色阴性，生化鉴定结果为：VP(-)、明胶液化(+)、木糖(-)、甘露醇(+)、鼠李糖(-)、肌醇(-)、淀粉酶(+)、硝酸盐还原(+)，结果与哈维氏弧菌一致。

2.2 噁喹酸在石斑鱼体内的代谢

分别对健康组和感染组石斑鱼在噁喹酸给药后各时间点采集血液样品，使用高效液相色谱检测血浆中噁喹酸浓度并拟合药时曲线。结果表明，噁喹酸在健康组和感染组石斑鱼血浆中的浓度均呈现先升高后降低的规律，在健康组中给药后0.5 h血药浓度达到峰值，而在感染组中给药后1 h达到峰值，之后均呈下降趋势。在0.5和24 h健康组的血药浓度极显著高于感染组,4、8、12和96 h健康组的血药浓度也显著高于感染组，而1、2、48和72 h健康组与感染组血药浓度组间差异不显著(图1)。总体而言，健康组的血药浓度高于感染组的血药浓度。

图1 健康组和感染组石斑鱼血浆中噁喹酸的药时曲线

将健康组和感染组石斑鱼血浆中噁喹酸的药时数据通过药代动力学软件winNonln 5.2.1进行房室模型拟合，结果发现,健康组和感染组石斑鱼血浆中噁喹酸的药时数据均符合一级吸收二室模型，药动学方程分别为：C=2 739.980e-2.545t+9.039e-0.026t-2 749.019e-0.270t；C=1 297.339e-0.745t+4.058 5e-0.013t-1 301.397e-0.921t。

噁喹酸在血浆中药动学参数如表2所示，感染组的达峰浓度低于健康组，达峰时间比健康组延后，血药浓度时间线下面积小于健康组但两组间的差异不明显，消除半衰期长于健康组。

表2 各组别石斑鱼血浆中的药动学参数

2.3 哈维氏弧菌对噁喹酸的敏感性

11株哈维氏弧菌对噁喹酸的药敏实验结果显示,11株哈维氏弧菌对噁喹酸敏感性存在一定差异，但整体而言其最小抑菌浓度(MIC)值较低。其中，H4菌株的MIC值为0.5 mol·L-1；H2、H3、H5、H10和H11菌株的MIC值为1 mol·L-1；H1、H6、H7、H8和H9菌株的MIC值为2 mol·L-1。

3 小结与讨论

本研究中11株哈维氏弧菌对噁喹酸的MIC值为0.5～2 mg·L-1，与王元等[12]分析的35株哈维氏弧菌对噁喹酸的MIC值主要为0.15～2.5 μg·mL-1的结果相符合。研究表明，噁喹酸对引发海水养殖病害的溶藻胶弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌有明显的抑制效果，对淡水养殖致病菌嗜水气单胞菌也具有较明显的抑制效果[13]。因此，可以考虑将噁喹酸作为防治石斑鱼哈维氏弧菌感染的抗菌药。

抗菌药物临床动力学的研究过程中感染模型的建立至关重要。本实验基于Reed-Muench法分析[8]哈维氏弧菌对石斑鱼的LD50为1.2×105g-1鱼体重。陈献稿等[14]以腹腔注射法分析了哈维氏弧菌对石斑鱼的LD50，其结果为2.7×106g-1，林克冰[7]等通过肌肉注射、腹腔注射和创伤浸浴3种方式进行哈维氏弧菌感染实验，得到3种方式下哈维氏弧菌对石斑鱼的LD50分别为4.3×104、2.9×105和5.4×106g-1鱼体重。以上研究结果与本实验结果有所不同，可能是由于哈维氏弧菌株、感染剂量和感染方式的不同引起的。本实验以1.2×105g-1剂量进行腹腔注射感染，可以获得较为典型的感染症状，又没有引起快速死亡，符合人工感染模型的要求。

比较健康组和感染组石斑鱼体内噁喹酸药代动力学特征发现，哈维氏弧菌感染导致血药达峰时间延迟，达峰浓度降低，消除半衰期变长，血药浓度时间线下面积变小。这与刘彦等[15]比较达氟沙星在健康和鳗弧菌感染牙鲆体内的药物代谢动力学的结果一致。哈维氏弧菌感染后血药浓度时间线下面积和达峰浓度比健康组明显降低，达峰时间也有所推迟，这表明哈维氏弧菌感染会引起机体对药物的吸收能力下降，而消除半衰期变长表明感染会影响机体对药物的代谢能力。石斑鱼感染后药动学参数的改变可能是由于疾病影响了机体正常的生理、生化机能和器官功能状态，从而使药物的吸收、分布和代谢等均发生了变化。因此,在制定临床给药方案时，需要充分考虑疾病因素对药物量效关系的影响。噁喹酸是浓度依赖型的喹诺酮药物，研究表明Cmax/MIC和AUC0-24/MIC值是评价其疗效的关键指标，当AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC>8时可获得理想的临床疗效[16-17]。在本实验中，感染条件下血药达峰浓度Cmax为11.32 mg·L-1，MIC为1 mg·L-1，Cmax/MIC>8，因此在感染情况下，可以采用20 mg·kg-1的体质量给药方案。