柑橘实生幼苗倍性检测的最佳部位

王平，聂振朋，孙立方，黄秀，徐建国，柯甫志

(浙江省柑橘研究所 国家品种改良分中心，浙江 黄岩 318026)

柑橘品种在自然受精的情况下普遍存在多倍体后代的现象，这种特性为柑橘实生苗选育不同倍性后代提供了基础[1-4]。流逝细胞术法鉴定倍性快速、简便、准确率高，是目前倍性选育的通用方法。由于叶片取材容易，目前包括柑橘在内的不同物种流逝细胞术法鉴定倍性时，选取的部位大多采用叶片组织[1-6]。本研究比较了不同部位对柑橘实生幼苗倍性测定结果的影响，旨在选出不同柑橘品种倍性测定取材的最佳部位。

1 材料与方法

1.1 材料

3个砧木品种(枸头橙、香橙和枳壳，2倍体材料)和4个柑橘栽培品种(本地早、日本夏橙、鸡尾葡萄柚和真龙柚，2倍体材料)的种子去皮后播于蛭石中萌发，发芽2～3周(叶2～3片)后，分别取嫩根、嫩茎和嫩叶3个部位用于倍性鉴定。

1.2 倍性测定

检测试剂采用Sysmex公司生产CyStain UV Precise P试剂盒，即先加0.4 mL提取液置于样品表面，用刀片切碎叶片培养30 s后过滤出液体，加1.6 mL DNA染色液后待测。仪器采用CyFlow® Space PARTEC流式细胞仪。以2倍体本地早嫩根为固定参考系，电压设置为2倍体本地早的第1个样本出峰值在90左右。

1.3 数据处理

每个品种测定10株重复，计算平均值、标准偏差和偏离均值度。偏离均值度/%=|(测定值-均值)|/均值×100，10个测定值中最大的偏离均值度用V表示。显著性差异分析采用IBM SPSS统计软件的Duncan多重比较法(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 柑橘不同部位流逝细胞术鉴定的出峰图

柑橘实生幼苗的嫩叶、嫩茎和嫩根3个部位出峰结果有所不同。除第1个杂质峰外，嫩叶(图1中A)和嫩茎只出一个明显的样本峰，嫩根(图1中B)出现两个明显的样本峰，且第2个样本峰值是第1个的2倍。这可能跟嫩根细胞处于活跃的分裂周期有关。本试验计算嫩根出峰值时以第1个样本峰值为准。

2.2 不同柑橘品种不同部位倍性测定结果比较

表1显示，在被测的3个砧木品种中，不同部位出峰值均较稳定，不同部位的测定均值未达到5%的显著性差异。表2显示，在栽培品种中，同一品种不同部位的出峰均值存在差异，本地早、日本夏橙和鸡尾葡萄柚3个栽培品种嫩根的出峰值明显要比嫩叶的大，其出峰均值分别为嫩叶的1.38倍、1.35倍和1.22倍，而真龙柚不同部位测定均值差异相对较小。在被测的7个品种中，根的测定结果均很稳定，不同品种的最大偏离均值仅浮动在1.8%～6.4%(表1和表2)；不同植株叶片测定结果稳定性最差，尤其是本地早和日本夏橙两个品种，叶片测定值中偏离均值最高分别达到33.3%和24.1%(表2)，一定程度上影响倍性结果判断。

横坐标表示DNA含量；纵坐标表示所检测的细胞数量图1 枸头橙嫩叶(A)和嫩根(B)的出峰情况

表1 砧木不同部位实生幼苗出峰值

表2 栽培品种不同部位实生幼苗出峰值

3 小结

流逝细胞术在植物倍性育种工程中普遍应用，目前柑橘上利用流逝细胞仪测定倍性的部位普遍采用柑橘嫩叶[1-4]，而本试验比较2倍体实生幼苗不同部位后得出柑橘叶片测定最不稳定、数据标准差最大，茎次之，根最小；但不同组织对砧木品种测定结果影响较小。被测的7个柑橘品种中，本地早、日本夏橙柑橘品种实生幼苗叶片测定值中偏离均值最高分别达到33.3%和24.1%，用叶片组织筛选这两个品种的3倍体植株就会出现一定几率的假阳性。同时用叶片检测时容易出现样本峰不能很好分离，易造成检测仪器堵塞。这可能跟叶片组织中含有丰富的次生代谢物质有关。本研究结果表明，用流逝细胞仪对柑橘品种的实生苗进行倍性选育时，尤其是栽培品种的三倍体植株鉴定时，取材部位宜选用嫩根组织。