过敏性哮喘患者外周血单个核细胞miR-138表达及与Th1/Th2平衡的关系

刘燕 李淑杰 罗云

过敏性哮喘(allergic asthma，AAS)是以气道高反应性为特征的可逆性气道阻塞性疾病，主要由肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症，临床表现主要为喘息、气促、胸闷和久咳[1]。我国AAS发病率约为1.8%，呈持续增长趋势[2]。有研究表明，AAS发病机制与复杂的环境因素和多种遗传位点相互作用存在关联，迄今为止仍未找到满意治疗方法[3]。另研究发现miRANs在AAS发生和治疗中起关键作用[4]。另外T辅助细胞1(T helper cell type 1，Th1)/T辅助细胞2(T helper cell type 2，Th2)细胞亚群表达与失衡处于哮喘发病机制研究的中心位置[5]。但AAS患者中miR-138与Th1/Th2平衡的关系目前尚未见报道。因此本研究通过探究AAS患者外周血单个核细胞miR-138表达及其与Th1/Th2平衡的关系，旨在揭示AAS病理过程提供一定参考。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2017年2月至2019年4月收治的AAS患者106例作为AAS组，其中男62例，女44例;年龄26～47岁，平均年龄(37.54±8.21)岁；另选取本院同期健康体检者100例作为对照组，其中男58例，女42例;年龄25～48岁，平均年龄(38.71±8.69)岁。2组受试者性别比、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准通过，所有受试者对本研究知情并自愿签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①AAS组患者符合《中国支气管哮喘防治指南》诊断标准[6]并经高年资医生确诊为哮喘患者；②过敏性哮喘为有明确的过敏史或皮试试验、血清过敏原特异性抗体对1项以上常见吸入性过敏原呈阳性；③患者入组前未应用糖皮质素或其他免疫抑制剂。

1.2.2 排除标准：①合并慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺结核等肺部疾病；② 1周内有急性感染史者；③合并类风湿、糖尿病等慢性病；④患有心、脑、肺等基础器官疾病者。

1.3 方法

1.3.1 样本采集:入组时分别取2组受试者空腹静脉外周血5 ml，置于含抗凝剂的离心管中，取部分抗凝血，用人单个核细胞分离液试剂盒(北京索莱宝科技有限公司生产)分离外周血单个核细胞备用，具体实验操作严格按照说明书进行。另一部分抗凝血用于Th1/Th2相关检测。

1.3.2 外周血单个核细胞miR-138、T-bet、GATA3表达水平检测:采用Trizol Reagent试剂盒(购于美国 Invitrogen公司)提取外周血单个核细胞总RNA，提取后采用琼脂糖电泳方法检测RNA的完整性。严格按照逆转录试剂盒(购自美国Promega公司)操作说明将2 μl 完整无降解RNA反转录为cDNA，参考SYBR Green RCR master mix试剂盒(购自大连宝生物公司)说明书加配反应体系，每个样本设置3个重复。反应体系加配完成后以ABI 7300 Real-time PCR System 完成。反应条件：96℃ 4 min，预变性，然后三步法反应：94℃ 30 s， 58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环，反应结束后收集全部实验数据。miR-138以U6为内参基因，T-bet、GATA3以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt相对定量的方法计算2组受试者外周血单个核细胞中miR-138、T-bet、GATA3的相对表达量。所用引物序列由下表可见。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 2组受试者外周血单个核细胞Th1/Th2比值及血清相关细胞因子水平检测:采用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent AASay,ELISA)测定2组受试者血清白介素2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)表达水平，检测试剂盒均购Abcam公司，多功能酶标仪购自美国Bio-Rad公司，试验操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。Th1/Th2比值采用Attune NxT流式细胞仪(美国ThermoFisher Scientific公司)检测：肝素抗凝外周血加入PMA、IS和BFA，37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。加入CD3CD8抗体孵育15 min，裂解，破膜，加入INF-γ-FITC、IL-4-PE抗体分别标记细胞，孵育20 min，洗涤后上机检测。本研究所有样品的检测均由检验科同一批人员在同台仪器上操作，每个样本重复3次，以3次检测平均值记为最终实验结果。

2 结果

2.1 2组受试者外周血单个核细胞miR-138表达水平分析 AAS组患者外周血单个核细胞miR-138表达水平中(1.73±0.29)，显著高于对照组的(1.02±0.24)，组间比较差异有统计学意义(t=19.082,P<0.05)。见图1。

2.2 2组受试者Th1/Th2比值及相关细胞因子表达水平分析 AAS组患者血清IL-2、IFN-γ含量显著低于对照组(P<0.05)，IL-4和IL-10显著高于对照组(P<0.05)；AAS组患者Th1/Th2比值显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

图1 2组受试者外周血单个核细胞miR-138表达水平分析

表2 2组受试者Th1/Th2比值及相关细胞因子表达水平分析

2.3 2组受试者Th1/Th2相关转录因子表达水平分析 AAS组患者外周血单个核细胞中转录因子T-bet mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)，AAS组患者转录因子GATA3 mRNA显著高于对照组(P<0.05)。见表3。

2.4 过敏性哮喘患者外周血单个核细胞miR-138表达水平与Th1、Th2相关细胞因子相关性分析 miR-138表达水平与细胞因子IL-2、IFN-γ水平呈负相关(r=-0.566、r=-0.616,P<0.05)，与细胞因子IL-4、IL-10呈正相关(r=0.518、r=0.506,P<0.05)。见图2。

表3 2组受试者Th1/Th2相关转录因子表达水平分析

图2 miR-138表达水平与Th1、Th2相关细胞因子相关性分析

2.5 过敏性哮喘患者外周血单个核细胞miR-138表达水平与Th1、Th2相关转录因子mRNA水平相关性分析 Pearson相关性分析结果显示miR-138表达水平与Th1相关转录因子T-bet mRNA水平呈负相关(r=-0.497,P<0.05)，与Th2相关转录因子GATA3 mRNA水平呈正相关(r=0.653,P<0.05)。见图3。

2.6 过敏性哮喘患者外周血单个核细胞miR-138表达水平与Th1/Th2比值的相关性 过敏性哮喘患者外周血单个核细胞miR-138表达水平与Th1/Th2比值呈负相关(r=-0.606,P<0.05)。见图4。

3 讨论

AAS是常见的顽固性气道慢性疾病，气道炎症是其最主要的症状，气道中的炎症可导致气道重构，发生永久性的损伤，最终导致慢性支气管炎及肺心病[7,8]。AAS具有发病率高、危害性大、持续时间长等特点，及时发现并干预治疗可显著减轻患者痛苦[1]。AAS发病受遗传和环境等多种因素影响，具体发病机制尚不清楚。已有研究显示Th1/Th2失衡在AAS发病过程中发挥着关键作用[5]，但Th1/Th2平衡与AAS发病的关键靶标基因等生物标志物的相关性研究较少。因此，寻找与AAS患者Th1/Th2平衡相关的生物标志物对揭示AAS发病机制，为寻找有效的治疗策略提供一定参考。

图3 miR-138表达水平与Th1、Th2相关转录因子相关性分析

图4 miR-138表达水平与Th1/Th2比值的相关性分析

miRNAs由RNA聚合酶Ⅱ经复杂加工形成的成熟miRNAs，是一类非编码小片段单链RNA，通过形成RNA诱导沉默复合体，干扰靶基因RNA的稳定性和翻译过程，调控靶基因的表达[9]。研究表明，miRNA在多种类型细胞中控制复杂信号通路，通过调控免疫反应和炎性反应，在AAS发生过程中挥发重要作用[4]。miR-138与免疫反应和肿瘤发生调控等多种过程有关，在AAS发生过程中发挥着不可或缺的作用[10]，提示miRNA参与免疫应答反应和AAS发生过程。miR-138通过调控Runx3表达在哮喘患者发病过程中发挥重要作用[11]。Wei等[10]研究发现miR-138通过结合CTLA-4、PD-1参与T淋巴细胞有关的免疫反应过程，提示miR-138与炎症免疫反应有关。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，单核细胞是血液中最大的白细胞，是巨噬细胞和树突状细胞的前身，参与炎症免疫等相关过程[12]，研究单个核细胞中miRNAs的表达对AAS病程监测有一定意义。本研究结果显示AAS组患者外周血单个核细胞miR-138表达水平显著高于对照组(P<0.05)，提示miR-138在AAS患者外周血单个核细胞中miR-138高表达，可能参与AAS的发病过程。

Th1/Th2平衡在研究AAS发病机制研究过程中处于核心位置[5]。Th1和Th2是两种不同生物学功能的辅助性T淋巴细胞，Th1细胞主要产生分泌IL-2、IFN-γ等，可促进细胞免疫，Th2细胞主要产生分泌IL-4、IL-10等，主要参与体液免疫[13]。IL-4可促进Th0细胞向Th2细胞分化，使Th1细胞比例相对减少。正常情况下Th1细胞和Th2细胞处于动态平衡状态，维持正常的细胞免疫和体液免疫功能[14]。Th1/Th2失衡，促进AAS的发病过程[5]。Kim等[14]发现Th1、Th2相关细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平可反应Th1/Th2平衡状态。本研究结果显示AAS组患者Th1相关细胞因子IL-2、IFN-γ含量显著低于对照组，Th2相关细胞因子IL-4、IL-10显著高于对照组，提示AAS患者血清Th2相关细胞因子水平升高，AAS组患者Th1/Th2比值显著低于对照组，表明AAS患者体内Th1/Th2平衡失调，向体液免疫方向偏移，与Qiu等[11]发现IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10在哮喘患者血清中含量变化一致，提示Th1、Th2相关细胞因子参与AAS发病过程。T-bet和GATA3转录因子分别是Th1、Th2相关转录因子，T-bet、GATA3表达水平与Th1/Th2平衡显著相关[15]。本研究结果显示AAS组患者外周血单个核细胞中转录因子T-bet mRNA表达水平显著低于对照组，GATA3 mRNA显著高于对照组，提示T-bet、GATA3 mRNA表达水平可能与AAS发病有关。

miRNA通过调控复杂信号通路，参与疾病发生、进展等过程，探究miRNA在AAS发病机制中的作用，对AAS治疗有积极意义。本研究结果显示miR-138与IL-2、IFN-γ水平呈负相关，与IL-4、IL-10水平呈正相关，提示miR-138高表达可能抑制Th1相关细胞因子表达，促进Th2相关细胞因子表达。进一步研究发现，miR-138表达水平与Th1相关转录因子T-bet mRNA水平呈负相关，与Th2相关转录因子GATA3 mRNA水平呈正相关，进一步揭示miR-138可能通过影响T-bet、GATA3 mRNA水平进而影响Th1、Th2相关因子因子表达。Fu等[16]研究发现在银屑病中miR-138通过RUNX3通路影响IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、T-bet、GATA3等因子影响Th1/Th2平衡。本研究分析发现miR-138与Th1、Th2细胞亚群比值呈负相关，提示提示AAS患者外周血单个核细胞中miR-138水平与Th1/Th2比值密切相关，可能通过调节Th1/Th2影响机体炎症反应。但miR-138与Th1/Th2相关因子是否存在直接调控关系尚不清楚，有待进一步研究。

综上所述，AAS患者外周血单个核细胞miR-138表达水平上调，可能通过调节Th1/Th2影响相关细胞因子表达，影响AAS患者机体炎症状态，但miR-138对Th1/Th2平衡的具体调控机制有待进一步研究。