临床孤立综合征患者外周血T 细胞受体β链可变区多态性研究

吴岩 张纪红 董会卿 李大伟 刘峥 万岁桂

临床孤立综合征（CIS）是一种十分常见的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，为中枢神经系统首次发作的单病灶或多病灶脱髓鞘事件，亦是复发-缓解型多发性硬化（RRMS）的早期阶段［1-2］；常见损害部位包括视神经、脑干、脑室旁和脊髓等［2］。免疫系统尤其是T 淋巴细胞（包括CD4+T 细胞、CD8+T 细胞）在脱髓鞘疾病的致病过程中发挥重要作用，可以直接或通过分子模拟机制对髓鞘自身抗原发生反应而致病［3］。T 淋巴细胞的免疫活动基本通过T 细胞受体（TCR）实现，TCR 由αβ或γδ两条肽链构成，TCR β链可变区（TCRVβ）具有高度特异性，可反映TCR 表达变化。在目前已公布的研究结果中，较少关注临床孤立综合征患者TCRVβ多态性，而且至今在TCR基因位点与临床孤立综合征之间亦未发现明确的遗传与致病相关性［4］。本研究以首都医科大学宣武医院神经内科近年收治的30 例临床孤立综合征患者为观察对象，分析其CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ多态性，初步预测特异性TCRVβ片段表达水平，并讨论其对临床孤立综合征的诊断价值。

对象与方法

一、研究对象

1.纳入与排除标准 （1）CIS 的诊断符合国际多发性硬化国际学会联合会（IFMSS）2010 年诊断标准（McDonald 标准）中有关CIS 诊断标准。（2）入院前6 周内未曾使用过糖皮质激素，以及入院前3 个月未曾使用免疫抑制剂。（3）排除血常规、红细胞沉降率检查结果正常的急性或慢性感染性疾病、恶性肿瘤性疾病或其他自身免疫性疾病。（4）入组患者及其家属对研究项目知情同意并签署知情同意书。

2.一般资料 （1）CIS 组：2012 年9 月至2014 年3 月在首都医科大学宣武医院院神经内科住院治疗且诊断明确的CIS 患者30 例，男性16 例，女性14 例；年龄11 ～66 岁，平均（37.17±16.07）岁。（2）正常对照组：同期在我院行健康体检的30 例受试者为对照，年龄21 ～40 岁，平均（31.23±5.98）岁。两组受试者性别（χ2= 0.067，P= 0.796）和年龄（t= 1.350，P=0.182）差异无统计学意义，具有可比性。

二、研究方法

1.材料与仪器 TCRVβ单克隆抗体试剂盒（货号：IM3497，规格：25TEST，含TCRVβA～H 共8 支试剂）中Ⅰ抗工作液包括异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）或藻红蛋白蓝蛋白5.1（PECY5）标记的小 鼠 抗 人CD4、CD8 和TCR α β 单 克 隆 抗 体，以 及CD3 PerCP、CD8 APC、红细胞裂解液和磷酸盐缓冲液（PBS）均购自美国BD 公司。BY-600c 离心机由北京白洋医用离心机有限责任公司提供，FACS Calibur 四色双激光流式细胞仪购自美国BD 公司。

2.流式细胞术检测 采集患者空腹时肘正中静脉或贵要静脉血2 ml 至EDTA 抗凝管，取1 支试管分 别 滴 加CD3-PerCP（20 μ l）、CD8-APC（5 μ l）和TCRVβ（5 μl，A ～H），加入经充分混匀的100 μl 抗凝血，摇匀、室温避光20 min。加入2 ml 红细胞裂解液，摇匀、室温避光10 min，2600×g离心5 min，去上清、PBS 冲洗（×2），加入质量分数1%多聚甲醛溶液1 ml，摇匀、4 ～8 ℃冰箱保存，24 h 内上机检测。流式细胞仪上机操作，发射激光采用氩离子激光器，功率15 mW，激发光波长488 nm，测定前以标准校正荧光微球校正仪器，每检测管共收集10×103个细胞，其中FITC、PE、PECY5 荧光分别设定在1、2、3通道上。应用CELL Quest Pro 5.1 多功能数据获取分析软件获得以下各项指标。（1）常规免疫学指标：包括淋巴细胞比例、T 淋巴细胞占淋巴细胞比例、CD4+T 细 胞 占T 淋 巴 细 胞 比 例、CD8+T 细 胞 占T 淋 巴细胞比例、CD4+T 细胞/CD8+T 细胞比值。（2）TCRVβ亚家族表达变化：检测CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ所含24 个亚家族成员表达水平，分别为Vβ1、Vβ2、V β 3、V β 4、V β 5.1、V β 5.2、V β 5.3、V β 7.1、V β 7.2、Vβ8、Vβ9、Vβ11、Vβ12、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ14、Vβ16、Vβ17、Vβ18、Vβ20、Vβ21.3、Vβ22 以及Vβ23。以TCRVβ每个片段的表达水平≥10%为存在扩增，TCRVβ扩增程度分别以扩增个数（TCRVβ表达水平≥10%的片段个数）及扩增分数（TCRVβ扩增的各个片段表达水平之和）表示。

3.统计分析方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行数据处理与分析。计数资料以相对数构成比（%）或率（%）表示，行χ2检验。通过Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用两独立样本的t检验；呈非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距［M（P25，P75）］表示，采用Mann-WhitneyU检验。绘制受试者工作特征（ROC）曲线并计算曲线下面积（AUC）以 评 价TCRV β 片 段 对CIS 的 诊断价值，AUC>0.70 具有中等诊断价值、≤0.70 则具有低等诊断价值；计算TCRVβ片段诊断CIS 的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Youden 指数（YI）。以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

表1 CIS 组与正常对照组受试者外周血常规免疫学指标的比较（x±s，%）Table 1. Comparison of general immune index in peripheral blood between CIS group and normal control group (x±s, %)

结 果

流式细胞术检测结果显示，CIS 组与正常对照组受试者外周血淋巴细胞比例、T 淋巴细胞占淋巴细胞比例、CD4+T 细胞占T 淋巴细胞比例、CD8+T 细胞占T 淋巴细胞比例、CD4+T 细胞/CD8+T 细胞比值差异均无统计学意义（P>0.05，表1）。

在TCRVβ家族的24 个亚家族中，CIS 组患者外周血CD4+TCRVβ2、4、5.2、5.3、7.1、8、11、14、17、20、21.3 片段，以及CD8+TCRVβ4、9、11、14 片段表达水平与正常对照组之间差异均有统计学意义（P<0.05 或P< 0.01）；其 中 仅CD4+TCRV β 11 和CD8+TCRVβ9、11 片段表达水平低于正常对照组，其余亚家族片段表达水平均高于正常对照组（表2，3）。

在TCRVβ家族的24 个亚家族中，CIS 组患者CD4+TCRV β 2（P= 0.002）和CD8+TCRV β 14（P=0.010）两个亚家族片段扩增者比例高于正常对照组且差异有统计学意义；两组其余亚家族扩增者比例差异无统计学意义（均P>0.05；表4，5）。

两组受试者总TCRVβ扩增者比例差异无统计学意义（P= 0.052），其中CIS 组患者外周血CD4+TCRVβ扩增者比例高于正常对照组（P=0.000），而CD8+TCRVβ扩增者比例与正常对照组差异无统计学意义（P=0.796，表6）。

CIS 组患者外周血TCRVβ扩增个数（P=0.001）和扩增分数（P=0.006）均高于正常对照组且差异有统计学意义。其中，CIS 组CD4+TCRVβ 扩增个数（P=0.000）和扩增分数（P=0.000）均高于正常对照组，而CD8+TCRVβ扩增个数和扩增分数与正常对照组间差异无统计学意义（均P>0.05；表7，8）。

表2 CIS 组与正常对照组受试者外周血CD4+TCRVβ 24 个亚家族表达水平的比较［M（P25，P75）］Table 2. Comparison of the quantitative expression of 24 subfamilies of CD4+TCRV β in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表3 CIS 组与正常对照组受试者外周血CD8+TCRVβ 24 个亚家族表达水平的比较［M（P25，P75）］Table 3. Comparison of the quantitative expression of 24 subfamilies of CD8+TCRV β in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表4 CIS 组与正常对照组受试者外周血CD4+TCRVβ 24 个亚家族扩增者比例的比较［例（%）］Table 4. Comparison of the frequency of amplification in 24 subfamilies of CD4+TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case(%)]

表5 CIS 组与正常对照组受试者外周血CD8+TCRVβ 24 个亚家族扩增者比例的比较［例（%）］Table 5. Comparison of the frequency of amplification in 24 subfamilies of CD8+TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case(%)]

将两组受试者亚家族表达水平或存在扩增者比例具有统计学差异的片段，根据该片段表达水平，假设不同临界点，获得一系列诊断灵敏度和特异度：以灵敏度为纵坐标，1-特异度为横坐标，绘制ROC 曲线。AUC 反映的范围即为诊断准确性，AUC>0.70 则该片段诊断CIS 具有中等诊断价值，AUC ≤0.70 则具有低等诊断价值。结果显示，CD4+TCRV β4 诊断CIS 的AUC 为0.719（95%CI：0.592 ～0.851，P= 0.003；图1），灵敏度83.33%、特 异 度56.67%；CD4+TCRV β 14 诊断CIS 的AUC 为0.713（95%CI：0.581 ～0.845，P= 0.005；图2），灵敏度70%、特异度56.23%；CD8+TCRVβ4 诊断CIS 的AUC为0.727（95%CI：0.600 ～0.854，P=0.002；图3），灵敏度93.33%、特异度50%；以上3 个片段对CIS 均具有中等诊断价值。CD4+TCRVβ2 和CD8+TCRVβ14 这两组亚家族表达水平及扩增者比例差异均有统计学 意 义，其 诊 断CIS 的AUC 分 别 为0.681（95%CI：0.543 ～0.819，P=0.016；图4）、0.652（95%CI：0.512 ～0.792，P= 0.043；图5），灵 敏度 分 别 为33.33%和43.37%，特异度为88.89%和54.55%，其对CIS 的诊断价值较低（表9）。

讨 论

2005 年由国际临床孤立综合征研讨会撰写的《提示转归为多发性硬化的临床孤立综合征》将该综合征大致分为3 种类型，即时间和空间均为孤立；时间孤立，空间多发；病变在同一部位反复出现，空间上是孤立的，时间上可为多次的［2］。其常见损害部位有：视神经、脑干、脑室旁以及脊髓等［5］，被认为是多发性硬化的早期阶段。临床孤立综合征患者是否会进展为多发性硬化目前尚缺乏临床证据证实［6-7］。有些研究通过对脑脊液或MRI 病灶等辅助检查指标的观察分析，预测疾病进展情况。Schwenkenbecher 等［1］对120 例临床孤立综合征患者进行为期24 ～87 个月的随访（中位随访时间47 个月），其中50 例（41.67%）后续进展为多发性硬化；脑脊液寡克隆区带（OCB）阳性者73 例、阴性47 例，阳性者中40 例（54.79%）、阴性者中10 例（21.28%）进展为多发性硬化，OCB 阳性患者进展为多发性硬化的比例明显高于阴性者，提示脑脊液OCB 检测对临床孤立综合征的进展可能具有一定预测作用。研究显示，MRI 异常的临床孤立综合征患者进展为多发性硬化的比例高达80%［8-9］。而且，在多发性硬化的早期阶段TCRVβ扩增针对新抗原短暂性存在，当抗原刺激减弱后，相应细胞群凋亡继而数目下降，致病主要抗原或反复出现的抗原使TCRVβ持续存在且扩增，随着脱髓鞘疾病的进展，导致TCRVβ扩增比例可能增高［10-11］。故监测临床孤立综合征患者外周血TCRVβ扩增表达水平可能对其是否会进展为多发性硬化做出初步判断。

表6 CIS 组与正常对照组受试者外周血TCRVβ扩增者比例的比较［例（%）］Table 6. Comparison of the amplification rate of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case (%)]

表7 CIS 组与正常对照组受试者外周血TCRVβ扩增个数的比较［M（P25，P75）］Table 7.Comparison of the amplification number of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表8 CIS 组与正常对照组受试者外周血TCRVβ扩增分数的比较［M（P25，P75）］Table 8. Comparison of the amplification percentage of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

TCR 是一种结构复杂的异二聚体，其将抗原片段识别为多肽，并与主要组织相容性复合物（MHC）结合［12］。T 淋巴细胞在发育过程中，表达TCRVβ的基因随机重排，健康人TCRVβ一般呈现多样性［13］，部分健康人会有1 个或以上TCRVβ克隆性扩增，并且与年龄存在一定关联性，年龄越大，扩增片段数目越多，20 ～30 岁人群无克隆性扩增，40 ～50 岁有1 ～2 个克隆性扩增［2］；脱髓鞘患者至少存在1 个主要克隆性TCRVβ（占所有受体>10%）［14］。本研究结果显示，正常对照组有17 例（56.67%）受试者出现TCRVβ扩增，CIS 组有24 例（80%）患者存在TCRVβ扩增，两组TCRVβ扩增者比例虽无明显差异，但正常对照组扩增者均为CD4+TCRVβ或CD8+TCRVβ单一片段扩增，而CIS 组则为CD4+TCRVβ和（或）CD8+TCRVβ多片段扩增；另外，CIS 组CD4+TCRVβ扩增者比例高于正常对照组，与Slansky 和Nakayama［15］研究所得出的T 淋巴细胞在脱髓鞘疾病自身免疫反应中CD4+TCRVβ扩增的结论相符。与此同时，CIS组扩增个数和扩增分数均显著高于正常对照组，提示中枢性或周围性免疫调节异常可导致髓鞘特异性T 淋巴细胞数目扩增至致病程度，产生更剧烈的免疫反应，进而导致炎性脱髓鞘疾病［16］。有研究表明，参与脱髓鞘疾病的T 淋巴细胞亚群主要为CD4+T 细胞［17］，T 淋巴细胞被认为是多发性硬化病理过程中的关键细胞，但是T 淋巴细胞在临床孤立综合征发生发展过程中的功能和抗原特异性尚不十分清楚［18］。

目前有关临床孤立综合征患者TCRVβ多态性的研究较为少见，相关研究的样本量较小，且研究对象大多为白种人群。Démoulins 等［19］曾对1 例临床孤立综合征患者进行脑脊液检测，其结果显示，该患者存在TCRVβ13、TCRVβ15、TCRVβ20 ～23 克隆性扩增。Mandel 等［14］于12 例临床孤立综合征患者症状出现3 个月内采集外周血，并以片段表达数量占总片段数量的10%～50%作为克隆性扩增诊断标准，经检测发现TCRVβ6 ～9 存在克隆性扩增，扩增率与健康对照组比较差异有统计学意义。然而，上述国外研究均未对CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ的克隆性扩增类型进行区分。本研究CIS 组患者CD4+TCRVβ2、4、5.2、5.3、7.1、8、11、14、17、20、21.3 片段，以及CD8+TCRVβ4、9、11、14 片段表达水平高于正常对照组，CD4+TCRVβ2、CD8+TCRVβ14 扩增者比例高于正常对照组，提示临床孤立综合征患者在TCRVβ扩增上具有特异性片段。Planas 等［20］对3 例多发性硬化患者进行外周血基因测序，结果显示，CD8+TCRVβ4、CD4+TCRVβ5 序列存在显著扩增，其中CD8+TCRVβ4 片段存在扩增与本研究结果相同，提示该片段可能对脱髓鞘疾病的诊断具有一定特异性；本研究CIS 组患者未检出CD4+TCRVβ5 序列存在扩增，可能与诊断标准和检测方法存在差异有关。另外，本研究CIS 组患者CD4+TCRVβ11 和CD8+TCRVβ9、11 片段表达水平均低于正常对照组，目前尚未在文献中检索到与本研究相类似的结果，其具体临床意义有待进一步探究。

图1 ROC 曲线显示，CD4+TCRVβ4 诊断CIS 的AUC为0.719（95%CI：0.592 ～0.851，P=0.003）Figure 1. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 4 in the diagnosis of CIS was 0.719 (95%CI:0.592-0.851, P=0.003).

图2 ROC 曲线显示，CD4+TCRVβ14 诊断CIS 的AUC为0.713（95%CI：0.581 ～0.845，P=0.005）Figure 2. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 14 in the diagnosis of CIS was 0.713 (95%CI:0.581-0.845, P=0.005).

图3 ROC 曲线显示，CD8+TCRVβ4 诊断CIS 的AUC为0.727（95%CI：0.600 ～0.854，P=0.002）Figure 3. ROC curve showed that the AUC of CD8+TCRV β 4 in the diagnosis of CIS was 0.727 (95%CI:0.600-0.854, P=0.002).

图4 ROC 曲线显示，CD4+TCRVβ2 诊断CIS 的AUC为0.681（95%CI：0.543 ～0.819，P=0.016）Figure 4. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 2 in the diagnosis of CIS was 0.681 (95%CI:0.543-0.819, P=0.016).

本研究所绘制的ROC 曲线提示，CD4+TCRVβ4、CD4+TCRVβ14、CD8+TCRVβ4 对临床孤立综合征具有中等诊断价值（AUC>0.70），表明通过外周血检测对TCRVβ进行分型可能对临床孤立综合征的早期诊断具有重要价值，但这些片段的敏感性相对较高、特异性相对较低，而且这些片段表达水平的临界值均未达到扩增水平，临床应用价值有限。本研究CIS 组患者CD4+TCRVβ2 和CD8+TCRVβ14 这两组亚家族表达水平及扩增者比例差异均有统计学意义，但其诊断临床孤立综合征的AUC ≤0.70，且敏感性较低，对于临床孤立综合征的早期诊断价值亦十分有限。然而，由于本研究样本量较小，且未进行脑脊液和MRI 等相关辅助检查，无法比较相关指标的关联性，相关研究结论尚待进一步研究加以验证。

图5 ROC 曲线显示，CD8+TCRVβ14 诊断CIS 的AUC为0.652（95%CI：0.512 ～0.792，P=0.043）Figure 5. ROC curve showed that the AUC of CD8+TCRV β 14 in the diagnosis of CIS was 0.652 (95%CI:0.512-0.792, P=0.043).

表9 TCRVβ亚家族对CIS 诊断效能的分析Table 9. Analysis of diagnostic efficiency of TCRV β subfamilies in CIS