18份团桑种质资源的ISSR分析＊

刘 玲，程 明，，唐仕成，郑 丹，柯皓天，李琼秀

（1.四川省丝绸工程技术研究中心，四川 成都 610031； 2.四川省丝绸科学研究院，四川 成都 610031）

四川幅员辽阔，自然环境复杂多样，拥有丰富的桑树资源，一些科研单位利用分子标记辅助育种、辐射育种、化学诱变等方法选育了大量桑树品种［1］，为蚕桑生产作出了很大贡献。四川省丝绸科学研究院长期致力于桑树育种及其分子生物学研究，目前已育成了人工四倍体桑品种团桑6号［2］和团桑 11号［3］、果桑品种团桑 9 号［4］，它们分别于2013年、2013年和2016年通过了四川省农作物品种审定委员会审定。目前在四川省丝绸科学研究院的桑树资源圃中保存着百余份种质资源，其中团桑2号、团桑3号、团桑4号、团桑B号、团桑5号、团桑10号、团桑12号、团桑13号和团桑14号已有选育报告但未审定，团桑1号、团桑3A号、团桑7号、团桑8号、团桑15号和团桑16号作为育种材料保存。为了更好地了解并利用这些资源，本研究采用ISSR分子标记对18份团桑资源进行了遗传多样性分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料取自四川省丝绸科学研究院资源圃（表1）。

表1 供试材料表Table 1 Name of materials used

1.2 DNA提取及质量检测

桑树基因组DNA采用稍加改进的CTAB法［5］，从0.15 g硅胶干燥的桑叶中提取。取3 μL提取到的DNA，在1%琼脂糖凝胶电泳20 min，电泳完毕后先后用紫外反射透射仪和微量紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度，将合格的DNA置于-20℃保存。

1.3 ISSR引物来源及筛选

参考英属哥伦比亚大学2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR在桑树方面的研究结果［6］，选择42个引物，由上海生工生物股份有限公司合成。以2份桑种质基因组DNA为模板，对42个引物进行PCR扩增，筛选出扩增条带多且清晰的引物用于后续实验。

1.4 ISSR-PCR反应及产物检测

PCR反应在Thermal Cycler（上海山富科学仪器有限公司）上进行。PCR反应体系（10 μL）如表2，PCR反应程序参照参考文献［6］。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min后，用紫外反射透射仪观察并拍照保存，用于后续的数据整理。

1.5 数据分析

手工记录不同迁移率条带。同一迁移率，根据条带的有无分别记为“1”和“0”，在Excel中形成数据矩阵，根据Nei's方法［7］，用Popgene32软件［8］评价引物的扩增效果，并采用非加权组平均法UPGMA对24份供试材料进行聚类分析。

表2 PCR反应体系（10 μL）Table 2 PCR reaction system（10 μL）

2 结果与分析

2.1 24份供试桑基因组DNA的ISSR扩增的多态性

从42条引物中筛选出9条扩增条带清晰的引物进行正式实验，9条引物共扩增出56条清晰条带，其中55条为多态性条带，多态性比率为98.21%；平均每条引物扩增出6.22条条带，其中6.11条为多态性条带；引物ID8扩增出的条带数最多为8条，多态性100%，引物ID6扩增出的条带数最少为4条，也全部具有多态性；所有引物扩增出的片段大小为200～2000 bp（图1，表3）。

表3 9条ISSR引物扩增结果Table 3 Amplification results of 9 ISSR primers

2.2 24份供试桑基于ISSR分子标记的聚类分析

以9条引物扩增的55条多态性条带为基础，利用Popgene32软件计算每份种质桑间的遗传相似系数和遗传距离。结果表明，24份供试桑的遗传相似系数为0.4643～0.9107，遗传距离为0.0935～0.7673。聚类分析图（图2）中，首先分出的是团桑14号，其余23份桑聚为一个大支，这一大支分为5个分支：团桑1号、团桑11号、团桑6号、团桑9号、团桑10号和团桑7号在分支①；团桑2号、团桑3号、团桑4号、团桑5号、团桑8号、团桑12号、白桑、蒙桑、团桑B号和华桑在分支②；团桑13号、团桑15号和山桑在分支③；团桑16号、鸡桑在分支④；团桑3A号和川桑在分支⑤。

3 小结与讨论

采用9条ISSR引物对18份团桑资源和6份野生桑进行遗传多样性分析，共扩增出56条条带，其中多态性条带55条，占98.21%，平均每条引物扩增出6.22条条带。24份供试桑的遗传相似系数为0.4643～0.9107，遗传距离为0.0935～0.7673。在UPGMA聚类分析中，团桑14号首先被分出，其余的23份桑聚为一个大支。团桑14号是盘桑2号（是四川省三台蚕种场从一株30年树龄的老桑树上采穗，进行嫁接繁殖，从中选出的丰产性能好、桑椹多而大、春季叶片大的叶果兼用桑品种［9］）经秋水仙素诱导得到的，其单独被分出，说明其遗传背景与其他23份桑资源不同。

团桑6号和团桑9号聚在分支①中，这两个品种有相同亲本。团桑6号是以二倍体塘10×伦109的杂种实生苗为材料，用秋水仙碱溶液诱导其体细胞染色体加倍，经无性固定育成人工四倍体桑品种（2n=4x=56）［2］；团桑9号系从塘10×伦109 F1杂交桑的果桑株系中选出的果用桑品种［4］。

团桑13号系将二倍体塘10×伦109 F1幼苗诱导为四倍体，与二倍体四川花桑杂交而育成的杂种优势强、产叶量高、叶质优、生长旺盛的人工三倍体［10］，与团桑15号、山桑聚在分支③中，说明团桑13号、团桑15号、山桑的亲缘关系近。

团桑4号和团桑B号系四川省丝绸科学研究院从1.2万株丰驰桑中，经过初选、复选、扩大繁殖、田间测试中选出的［11］。团桑4号叶形肥大、产叶量高、全开雌花、结果多，可作为叶果兼用品系；团桑B号叶片较肥大、产叶量高、开少量雄花。这两个桑资源来源相同，都聚在分支②中。

聚类结果还说明团桑12号与白桑的亲缘关系近，团桑B号与华桑的亲缘关系近，团桑16号与鸡桑的亲缘关系近，团桑3A号与川桑的亲缘关系近。