松材线虫检测形态辨识法实践

谢丽玉

(三明市梅列区自然资源局森防站，福建 三明 365000)

1 引言

松材线虫病传入我国已有几十年了，由于松树感染初期潜伏期长，症状隐蔽却致病性极强，一旦表象显现已很难治愈，最短40多天内即可枯死，因而导致大面积松树林区遭遇毁灭性灾害。该松树枯萎病,也被公认为松树的“癌症”[1]。梅列区自2004年初发生松材线虫病疫情以来，加大除治力度，通过采取有效措施，有效遏制了的疫情蔓延、扩散势头。 2019年松材线虫病秋季普查，初步发现松枯死木476株，其中:不明原因67株,涉及松林小班面积461.2 hm2，分布在陈大镇台溪村、砂蕉村、台江国有林场，尤其在叶坑高速公路两侧及电力、通讯走廊周边松林较多。针对各个小班疑似感

染松材线虫松树实际表象，通过观察，对疑似病感松树采样，在伐倒木主干上、中、下部截取3 cm厚圆盘,带回实验检测。

2 材料与方法

2.1 材料

(1)调查和取样陈大镇台溪村、砂蕉村、台江国有林场不明原因松枯死木主干上、中、下部圆盘，取样工具有油锯和标本袋。

(2)样品松材线虫检测所需工具：劈刀、剪刀;线虫分离装置 ( 铁架,漏斗,乳胶管, 止水夹,餐巾纸,试管,滴管,酒精灯,载玻片,盖玻片等); XS-18C生物显微镜、电脑。

2.2 贝尔曼漏斗法

由贝尔曼提出的贝尔曼漏斗法是线虫学研究基本方法之一。因为装置简单操作方便，被广泛应用于松材线虫调查鉴定和检疫检验中[2]。分离松材线虫运用贝尔曼漏斗法时，通常需要将处理过的样品浸泡 24 h后，待过滤沉淀才能镜检是否有线虫。常规分离镜检法具体操作步骤：首先将直径12～18 cm的玻璃漏斗下端接一段长约10～15 cm的乳胶管，分别置于漏斗架上，并用止水弹簧夹夹住乳胶管下端确保不漏水；将标本逐一劈成小片，呈火柴杆大小状后剪碎，再把待分离样品用大小合适的纱布包好放入漏斗中，盛满清水完全浸泡,在线虫的趋水性和重力作用下，线虫逐步下沉至乳胶管底部。静置24 h后，用清洁的玻璃试管套住漏斗下方乳胶管尾端，轻捏止水弹簧夹接取线虫分离液约 5～10mL，放置试管架静置片刻，肉眼可见底液混浊。用吸管轻入试管底部取微量分离液，滴1、2小水珠于载玻片上，用盖玻片匀开分离液并盖上，搁至显微镜载物台上，打开摄影端，先用最小倍物镜搜索，锁定疑似目标，再转换更高倍的物镜放大观察，也可点击捕获截图鉴别。如有需要可用酒精灯或打火机将载玻片上的线虫热杀固定，以便于鉴别。

2.3 病原线虫形态学鉴定法

2.3.1 观察唇区、口针、中食道球形状情况

松材线虫的主要形态学特征: 成虫头部均具有明显的溢缩、口针和中食道球,其中唇区高溢缩明显，口针细且基部稍微膨大，中食道球呈卵形占其体宽的 2 /3 以上[3]。由于线虫幼期形态特征不稳定，很难鉴别雄雌，因此在鉴定过程中，幼虫不作为鉴定和判别的依据，一般要找到成虫才可进行进一步鉴别。

2.3.2 观察成虫的雌雄形态

松材线虫雄成虫的尾部呈圆锥形，交合刺大，呈弓状，喙突明显，远端膨大似盘状，向腹部弯曲如鹰爪，末端有一卵形交合伞包裹。这里应注意区分：拟松材线虫雄成虫交合伞端部平截为板状，而松材线虫雄成虫交合伞为卵圆形。在显微镜下雄成虫交合刺的形态比较明显，易于鉴别。但只有在找到雌成虫的特征后，才能做出判断。

松材线虫的雌成虫尾部形态为指形，虫体后部约73%处有阴门开口，并有较宽的阴门盖。熟记其尾部特征，再观察阴门盖，就能够迅速辨识松材线虫的雌成虫。如果发现部分雌成虫有短的尾尖突(通常小于2 μm)，鉴别时必须考虑与拟松材线虫的特征相对比进一步观察，拟松材线虫的尾部与雄松材线虫的尾部一样也呈圆锥状，但其尾端的尾尖突长度一般为 3.5～5 μm，比松材线虫的长[4]。 观察过程中，要注意把拟松材线虫和松材线虫区别开来。

表1 2019年秋季普查松材线虫病样品检测记录

3 结果与分析

通过对陈大镇台溪村、砂蕉村、台江国有林场样本进行的贝尔曼漏斗法实验形态学观察发现(表1),采样中近半有雄雌松材线虫,样树主干中部为感染多发区域，可能与松墨天牛取食产卵的选点有关。

4 小结与讨论

4.1 镜下观察体会

(1)通过多次镜下观察，发现虽然可采用电脑捕获截屏图辨识活体，但有些虫体活动过于活跃，需用打火机在载玻片下来回移动火苗烤3 s左右，使虫体固定便于观察。热杀固定后一般雌虫呈展开“C”形，雄虫成“J”形[5](图1～4)。

图1 砂蕉15-13-4固定后的雄虫

图2 台溪47-3-1 雌虫尾部

图3 台溪49-6-3 雌虫

图4 台江34-15-1雄虫特征

注意镜下观察时,先使用显微镜最小倍镜目浏览查看,一旦发现疑似虫体,再根据需要转换高倍镜目观察辨识。

(2)由于每批样本较多，浸泡24 h后的样液需尽快检测出结果，长时间俯身引颈，紧挨显微镜目镜搜寻身体容易疲劳。如果改善配置，使用带有摄影端的显微镜放置电脑显示屏旁，并连接电脑同步显像，只需端坐在电脑显示屏前观看屏幕，单手操作载物台移动手轮和聚光镜升降手轮调节即可。这对于需要长时间观察或者近视、老花眼观察不便的检测人员来说，不失为一种便捷方法。

4.2 讨论

(1)经过采样检测，陈大镇台溪村、砂蕉村、台江国有林场部分小班松树确定感染松材线虫病。由于该病种早期潜伏期长且隐蔽，针对松材线虫病的检测，除了活立木主干电钻取样外，还需进一步探究在染病初期能够有又快又方便、减少树体伤害的检测方法。尽管松材线虫的形态鉴定方法由于雌成虫的尾形、尾尖突、雄虫的交合伞端部形态在种间有部分重叠现象而可能造成错检缺陷，在松材线虫疫情反复、基层森防站人员少防治任务重、实验室条件简陋的情况下，目前基层多采用该方法，仍然有较普遍的实用性。只要熟练握采样、分离、鉴定几个重点环节的工作，基本上辨识准确率可达95%以上，为迅速准确辨识、加快后续环节的处置赢得时间。

(2)在常规的防疫除治基础上，倡导“预防性早诊治”理念，不能仅限于春秋季普查后统一除治，护林员巡山一旦发现有松树异常就要抓紧取样检测，简化程序及时诊断治疗。依据孟俊国的研究,松墨天牛的蛀入孔、蛹室和羽化孔分布在树枝上的数量要远高于树干上的[6]。这表明松墨天牛幼虫多集中在树枝危害，如果采样时间点提前，应注重树枝取样，在病感早期检测诊断，及时去除病枝，将病虫扼杀在萌芽状态。