番茄黄化曲叶病毒侵染危害海南番茄及其分子特征

汤亚飞　周洋　张丽　李正刚　佘小漫　于琳　蓝国兵　邓铭光　何自福

摘要：【目的】明確引起海南三亚、东方和陵水番茄黄化曲叶病的病毒分子特征，为防控该病害提供科学依据。【方法】以2019年2月从海南三亚、东方和陵水采集的15份疑似番茄黄化曲叶病样本为材料，采用菜豆金色花叶病毒属病毒的通用简并引物AV494/CoPR对15份样本进行PCR检测，并对PCR检测为阳性的样本进行滚环扩增（RCA）及基因克隆，获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的病毒基因组全序列，进而在GenBank数据库BLASTh程序进行相似性比对，利用SDT 1.2的MUSCLE alignment进行序列相似性比较分析，采用MEGA 6.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树，明确所获得病毒分离物与已报道分离物的亲缘关系。【结果】获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的3个番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）分离物基因组全序列，其大小均为2781 nt，编码6个开放阅读框（ORF），其中病毒链上AV1和AV2基因，互补链上AC1、AC2、AC3和AC4基因。相似性比对分析结果表明，TYLCV海南分离物与墨西哥和美国分离物的相似性在99.0%以上，与来自我国不同省（市）的14个TYLCV分离物的相似性在98.0%以上。系统发育进化分析显示，海南三亚、陵水和东方3个分离物与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物聚集在一个小分支，进一步与来自我国其他12个省（市）、韩国、哥斯达黎加和澳大利亚的分离物形成一个分支。【结论】侵染海南番茄的TYLCV可能来自我国大陆的番茄等种苗和烟粉虱带毒传入，也有可能来自墨西哥和美国等其他国家。

关键词： 番茄黄化曲叶病毒;分子鉴定;序列分析;海南

中图分类号： S432.41                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）08-1970-07

Tomato yellow leaf curl virus infecting tomato in Hainan

and its molecular characteristics

TANG Ya-fei1，2， ZHOU Yang3， ZHANG Li1， LI Zheng-gang1， SHE Xiao-man1，2，

YU Lin1， LAN Guo-bing1， DENG Ming-guang1， HE Zi-fu1，2*

（1Plant Protection Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou  510640， China;  2Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou  510640， China;

3Agricultural Service Center of Dongfang， Dongfang， Hainan  572600， China）

Abstract：【Objective】This study was to identify the molecular characterization of Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV） that caused tomato yellow leaf curl disease in Sanya， Dongfang and Lingshui of Hainan， in order to provide scientific basis for prevention and control of the disease in the area. 【Method】In February， 2019，15 suspected diseased tomato samples were collected from Sanya， Dongfang and Lingshui of Hainan. The 15 samples were detected by PCR using the universal degenerate primers AV494/CoPR for Begomoviruses. The PCR positive samples were amplified by rolling circle amplification（RCA） and cloned to obtain whole genome sequences of virus isolated from tomato in Sanya， Lingshui and Dongfang. These obtained sequences identity was compared and analyzed using BLAST on GenBank database. Pairwise nucleotide sequence identities were determined using SDT 1.2 with MUSCLE alignment. Phylogenetic  analysis was conducted using MEGA 6.0 with neighbor joining method to clarify the genetic relationship between isolates of obtained virus and the reported isolates. 【Result】Three whole genome sequences of TYLCV isolated from tomato in Sanya， Lingshui and Dongfang of Hainan were 2781 nucleotides （nt） long and encoded six open reading frames（ORFs）. The AV1 and AV2 were located on the virion sense DNA strand， whereas， the AC1， AC2， AC3， AC4 genes were located on the complementary sense strand. The results of identity comparison showed that TYLCV isolated from Hainan shared over 99.0% nt identities with Mexico isolate and USA isolate， and over 98.0% nt identities with the 14 isolates from different provinces or municipalities of China. The result of phylogenetic analysis showed that Sanya， Lingshui and Dongfang isolates clustered with isolates of TYLCV from Mexico， USA， Beijing and Jiangsu of China to form a unique clade， further clustered with all isolates from other 12 provinces or municipalities of China， South Korea， Costa Rica， Australia to form a clade. 【Conclusion】TYLCV infecting tomato in Hainan should come from other areas of China， or Mexico， the United States and other countries by transmitting through seedling and whitefly.

Key words： Tomato yellow leaf curl virus; molecular identification; sequence analysis; Hainan

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201209）;Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation（2019A1515012150）;Guangzhou Science and Technology Project（201904010173）;Guangdong Modern Agricultural Common Key Technology Research and Develpment Innovation Team Building Project（2019KJ134）

0 引言

【研究意义】番茄（Solanum lycopersicum）是海南冬种北运蔬菜作物之一，年种植面积约6667 ha，主要分布在陵水、东方、昌江和定安等市（县），是当地农民增收致富的重要经济作物。番茄黄化曲叶病是全球番茄生产上一种毁灭性病害，已在热带亚热带地区造成严重损失（Hanssen et al.，2010）。2008年，海南省海口市发生番茄黄化曲叶病（Zhang et al.，2010），近年来在海南多个番茄产区暴发流行，已造成巨大经济损失。因此，对引起海南番茄黄化曲叶病的病毒种类进行鉴定，明确其分子特征，可为该病毒病监测与防控提供依据，同时对促进海南番茄产业持续健康发展具有重要的指导意义。【前人研究进展】番茄黄化曲叶病是由烟粉虱传播的双生病毒侵染引起（朱晓林等，2019），但世界各地发生的番茄黄化曲叶病的病原病毒并不相同，国际上已报道可引起番茄黄化曲叶病的病毒有80多种（Brown et al.，2015），我国至少有16种（熊艳等，2011;Yang et al.，2011;Ding et al.，2016），其中番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）分布最广。TYLCV最早在以色列番茄中被发现，目前已扩散到中东、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亚洲等多个国家和地区（Moriones and Navas-Castillo，2000），是引起全球番茄黄化曲叶病的主要病原病毒之一。2006年，该病毒传入我国上海（Wu et al.，2006），之后在浙江、江苏、山东等20个省（区）发生（姜静等，2018;汤亚飞等，2019），造成严重的经济损失，已成为引起我国长江流域及其以北番茄产区黄化曲叶病的优势病毒种类。自从番茄黄化曲叶病在海南省发生以来，有研究者对引起海南番茄黄化曲叶病的病毒进行鉴定。Zhang等（2010）从2008年采集于海南海口的番茄病样中鉴定出海南番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Hainan virus，ToLCHnV）;林韶东（2013）从海南三亚崖城镇和乐东黄流镇番茄上检测到ToLCHnV和中国胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein China virus，AYVCNV）;班一云（2017）从海南番茄病样上检测到中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）。目前尚未见在海南番茄上检测到TYLCV的相关报道。【本研究切入点】2019年2月，本研究团队在海南省三亚市、东方市和陵水县番茄产区调查发现，田间番茄病株表现出严重的黄化、曲叶症状，调查田块的发病率达100%。种植者反映近几年番茄黄化曲叶病在海南省发生非常严重，给种植户带来惨重的经济损失，但具体是何种病毒种类引起该病害大暴发尚不明确。【拟解决的关键问题】采用菜豆金色花叶病毒属病毒的通用简并引物AV494/CoPR（Wyatt and Brown，1996;何自福等，2004）对海南省三亚市、东方市和陵水县番茄产区的疑似番茄黄化曲叶病样本进行PCR检测，并对PCR检测为阳性的病样进行滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA），再进一步通过分子克隆和序列分析，明确引起海南番茄黄化曲叶病的病毒分子特征，为防控该病害提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样品采集 于2019年2月从海南三亚、陵水和东方番茄产区采集田间表现典型黄化曲叶症状（图1）的番茄病样叶片15份，样本按采样地点做好标记，带回实验室用于检测;以人工注射接种TYLCV侵染性克隆引起发病的番茄植株叶片为阳性对照（CK+），室内未接种的健康番茄植株叶片为阴性对照（CK-）。

1. 1. 2 主要试剂和仪器设备 Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）和DNA片段纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司;DNA滚环扩增试剂盒（IllustraTM TempliPhiTM kit）购自GE Healthcare公司;pGEM-T EASY和pGEM-3Z/5Z载体购自美国Promega公司;T4-DNA连接酶和BamH I等快速限制性内切酶等购自美国NEB公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒（GeneJET Gel Extraction Kit）购自美国Thermo赛默飞公司;植物基因组DNA提取试剂盒（EasyPure Plant Genomic DNA Kit）购自北京全式金生物技术有限公司;大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;氨苄青霉素、X-gal、蔗糖、琼脂糖和胰蛋白胨均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;绿如蓝核酸染料DNAGREEN购自北京天恩泽基因科技有限公司;其他常规分析纯试剂购自广州市芊薈化玻仪器有限公司。T100TM Thermal cycler PCR仪和Universal HoodⅡ凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司;电泳仪购自美国E-C Apparatus Corporation公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 植物样品总DNA提取 分别取番茄病株、阴性对照和阳性对照叶片各100 mg，按照植物DNA提取试剂盒说明书上的步骤进行总DNA抽提，DNA沉淀溶解于50 μL ddH2O中，于-20 ℃冰箱保存备用。

1. 2. 2 PCR检测 利用检测菜豆金色花叶病毒属病毒的通用引物AV494/CoPR（Wyatt and Brown，1996;何自福等，2004）对采集的15份疑似番茄病样进行PCR检测。反应体系30.0 μL：植物总DNA 1.0 μL（约20 ng），Ex TaqTM Premix 15.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，灭菌水12.0 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃45 s，进行35个循环;72 ℃延伸 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 3 基因组全序列扩增 挑选PCR检测为阳性的代表病样，按照illustraTM TempliPhiTM Kit说明书进行RCA扩增：将待测样品总DNA 1.0 μL（约20 ng）与5.0 μL样品缓冲液混匀，95 ℃变性3 min;置于冰上冷却;加入5.0 μL反应缓冲液和0.2 μL DNA聚合酶，30 ℃恒温下反应18～20 h;反应结束后在65 ℃下加热10 min使酶失活，终止反应。RCA扩增产物分别用BamH I进行酶切。反应体系10.0 μL：RCA产物2.0 μL，BamH I内切酶1.0 μL，10×内切酶快速反应缓冲液1.0 μL，灭菌水6.0 μL。在37 ℃恒温条件下酶切0.5～2.0 h，最后进行电泳分析。

1. 2. 4 基因克隆与序列分析 将RCA产物酶切出大小约2.7或1.3 kb的目的条带进行回收纯化，并连接到用相同内切酶处理后的线性化pGEM-3Z载体上，转化至大肠杆DH5α感受态细胞，从每个平板随机挑取3个阳性单菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。对测序获得的基因序列利用DNAStar的SeqMan进行拼接，然后在GenBank数据库中BLASTn程序进行相似性比对，利用SDT 1.2的MUSCLE alignment对序列相似性作进一步比较分析（Muhire et al.，2014），采用MEGA 6.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）（Tamurak et al.，2013）构建系统发育进化树，Bootstrapping值设置为1000。

2 结果与分析

2. 1 PCR检测结果

利用检测菜豆金色花叶病毒属病毒的通用引物AV494/CoPR对采集的15份疑似番茄黄化曲叶病病样进行PCR检测，结果从15份疑似病样的总DNA中均扩增到1条与目的片断大小（570 bp）一致的特异性条带，阴性对照中未扩增出任何片段（图2）。表明海南番茄病样中存在菜豆金色花叶病毒属病毒。

2. 2 病毒基因组结构特征及序列分析结果

2. 2. 1 病毒基因组结构特征 从海南三亚、陵水和东方各选取1个PCR检测为阳性的病样进行RCA扩增，进一步对其产物进行酶切，3个RCA产物均能被BamH I内切酶切出1条大小约2.7 kb的单一条带，将该条带回收、克隆及测序，结果表明，来自海南三亚（SY）、陵水（LS）和东方（DF）的3个分离物全基因组大小均为2781 nt （GenBank登錄号分别为MK908813、MK908814和MK908815），且基因组结构特征完全一致，均为单链闭合环状，含6个开放阅读框（ORF），包括位于病毒链上编码外壳蛋白的AV1基因（308～1084 nt）和编码与病毒移动相关蛋白的AV2基因（148～498 nt），以及位于互补链编码复制酶蛋白的AC1基因（1542～2615 nt）、编码转录激活蛋白的AC2基因（1226～1633 nt）、编码复制增强蛋白的AC3基因（1081～1485 nt）和编码复制或转录调控因子的AC4基因（2171～2464 nt）。在AV2基因与AC1基因之间存在1个大小为313 nt的基因间隔区，该区域含有与该类病毒复制起始有关的保守序列TAATATTAC（位于2775～2782 nt）（Hanley-Bowdoin et al.，1999）。

2. 2. 2 相似性分析 经序列比对，发现侵染海南番茄的SY、LS和DF 3个分离物两两间序列相似性为98.9%、99.0%和99.2%，BLAST结果显示，与侵染海南番茄的病毒全基因组序列有较高相似性的序列均为TYLCV分离物。进一步采用SDT 1.2的MUSCLE alignment进行相似性比较分析发现（表1），海南分离物与墨西哥、美国、韩国、哥斯达黎加、澳大利亚、埃及6国以及我国14个不同省（市）的20个TYLCV分离物相似性在98.0%以上，其中与墨西哥和美国分离物的相似性在99.0%以上;与荷兰、古巴、约旦、格林纳达和波多黎各5国分离物的相似性在97.3%～98.3%;与科威特、伊朗、日本、法国、西班牙和伊朗6国分离物的相似性为91.7%～95.1%;与阿曼分离物的相似性最低，均低于91.0%，分别为90.3%、90.7%和90.2%。

2. 2. 3 亲缘关系分析 为明确TYLCV海南分离物与已报道的其他分离物之间的亲缘关系，将TYLCV海南分离物与上述33个分离物进行系统进化分析，以海南番茄曲叶病毒（FN434083）为外组。结果（图3）显示，海南SY、LS和DF 3个分离物与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物的亲缘关系最近，聚集在一个小分支，进一步与来自我国其他12个省（市）、韩国、哥斯达黎加和澳大利亚的分离物形成一个分支，而与伊朗和阿曼分离物的亲缘关系最远。

3 讨论

本研究首次从海南三亚、陵水和东方番茄黄化曲叶病病样中检测到TYLCV，并明确其大小为2781 nt，基因序列与来自墨西哥、美国及我国等17个国家32个TYLCV分离物的相似性均在91.0%以上，其中与我国其他不同省（市）的14个TYLCV分离物的相似性在98.0%以上，由此可知，入侵我国的TYLCV在基因序列上种群遗传稳定，目前尚未发现较大变异。

系统发育进化树显示TYLCV海南分离物与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物聚集在一个小分支，进一步与我国其他地区，韩国、哥斯达黎加、澳大利亚的分离物形成一个大分支。该结果表示TYLCV海南分离物与韩国、哥斯达黎加、澳大利亚、墨西哥、美国及我国其他地区分离物的亲缘关系近，其中与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物的亲缘关系最近，但与伊朗及阿曼分离物的亲缘关系较远。进一步推测出侵染海南番茄的TYLCV分离物可能是通过从北京和江苏等地调运的番茄种苗及烟粉虱带毒进入海南，也有可能通过从墨西哥和美国等其他国家进口的番茄、苗木及烟粉虱带毒等途径传入。

自从番茄黄化曲叶病在我国发生以来，各地的学者对该病害开展了相关研究，明确引起我国番茄黄化曲叶病的病毒种类复杂，且各省番茄黄化曲叶病的病毒种类存在很大差异。目前报道的病毒至少有16种（熊艳等，2011;Yang et al.，2011;Ding et al.，2016），其中TYLCV分布最广，是引起华东、华北和西北等广大番茄产區番茄黄化曲叶病的病原病毒。华南地区（广东、广西和海南）常年温暖多湿，烟粉虱全年可以繁殖，导致番茄黄化曲叶病发生非常严重，病毒种类也很复杂，目前报道的危害广东番茄的烟粉虱传病毒有4种，分别为广东番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Guangdong virus，ToLCGdV）（何自福等，2005b）、广东番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl Guangdong virus，TYLCGdV）（何自福等，2005a）、台湾番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV）（何自福等，2007）和TYLCV（汤亚飞等，2019）;危害广西番茄的烟粉虱传病毒有5种，分别为广西番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Guangxi virus，ToLCGxV）、中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV）、AYVCNV、中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus，PaLCuCNV）和TYLCCNV（刘玉乐等，1998;Xu et al.，2007;Li et al.，2017）;危害海南番茄的烟粉虱传病毒有3种，分别为ToLCHnV、AYVCNV和TYLCCNV（Zhang et al.，2010;林韶东，2013;班一云，2017）。由此可见，TYLCV虽然是引起华东、华北和西北等广大番茄产区番茄黄化曲叶病的病原病毒，但在华南地区仅广东省有分布，广西和海南尚未发现TYLCV危害番茄的报道。本研究首次在海南番茄上检测到TYLCV，可见该病毒在我国的危害范围还在进一步扩大，已严重制约我国番茄产业的发展。

TYLCV主要靠烟粉虱带毒和带毒种苗调运等途径进行传播扩散，因此对未发生的区域应严格把好种苗关，确保种植无毒种苗，从源头控制该病毒的危害。此外，生产上尽可能选择抗病品种，严控烟粉虱发生，加强田间管理，可有效控制番茄黄化曲叶病的发生与流行。

4 结论

侵染海南番茄的TYLCV可能来自我国大陆的番茄等种苗和烟粉虱带毒传入，也有可能来自墨西哥和美国等其他国家。本研究首次在海南番茄上检测到TYLCV，并明确其分子特征，为开展TYLCV在我国的扩散、种群遗传特征分析、病毒变异与进化等研究提供了素材，更为海南省番茄黄化曲叶病的防控提供科学依据。

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（責任编辑 麻小燕）

收稿日期：2019-12-16

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFD0201209）;广东省基础与应用基础研究基金项目（2019A1515012150）;广州市科技计划项目（201904010173）;广东省现代农业产业共性关键技术研发创新团队建设项目（2019KJ134）

作者简介：*为通讯作者，何自福（1966-），研究员，主要从事植物病理研究工作，E-mail：hezf@gdppri.com。汤亚飞（1980-），主要从事蔬菜病毒研究工作，E-mail：yf.tang1314@163.com