地表水中叶绿素a的提取方法探讨

郭永斌，雷赛芬

（1.云南三正技术检测有限公司，云南 昆明 650000；2.云南天博环境检测有限公司，云南 昆明 650217）

叶绿素a是浮游植物光合作用的重要载体，占细胞干重的1%～2%，因此浮游植物叶绿素a含量成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用[1]。目前叶绿素的检测主要有 《水和废水分析方法》（第四版）[2]， 《水质 叶绿素的测定 分光光度法》HJ 897-2017[3]标准方法用低温干燥，经过研磨、浸提法来提取叶绿素；《水质叶绿素的测定分光光度法》SL 88-2012[4]标准经反复冻融使细胞破裂后提取叶绿素。标准方法选用的溶剂都是丙酮，标准方法的检测步骤用时比较长，因此叶绿素分解等造成提取过程中损失较大，重复测定的精密度较差，提取不够完全。有研究对热乙醇法的误差进行了探讨及比较了丙酮法的差异[5，6]，有研究对超声波辅助热乙醇法提取对方法进行了优化[7]，本文综合了浮游藻类植物细胞破碎的方法，对叶绿素a的测定方法进行了优化探讨，得到一个快速高效的提取方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

723G可见光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司），SYU-7-200型超声波清洗仪（郑州生元仪器有限公司），FSH-2A可调高速匀浆机（方科仪器（常州）有限公司），离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。碳酸镁（国药集团化学试剂有限公司），乙醇（天津市光复化学试剂有限公司），丙酮（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 样品采集与保存

按照水质浮游植物的采样方法，在棕色玻璃瓶瓶中收集样品1L，如样品不能及时处理，每升水中需加1%碳酸镁1mL，并冷藏避光保存。样品采集后宜尽快分析完毕。本文中实验样品分别是样品1（河水）、样品2（湖水）、样品3（池塘水）。

1.3 叶绿素a的提取

将0.2mL碳酸镁悬浮液加入到一定量的样品中，混匀后用直径为60mm醋酸纤维滤膜抽滤，至过滤器内无水后再抽吸几分钟。把载有浓缩样品的滤膜放入离心管中（离心管外表用锡箔纸或黑色塑料袋包裹，避免叶绿素见光分解），置于-25℃的冰箱中30min，取出后加入5mL 70℃热乙醇，用高速匀浆器匀浆5min，在置于70℃超声波中破碎30min，以 4000r／min离心 5min，吸取上清液于10mL比色管中，再在离心管中加入热乙醇3mL和2mL，同样的操作步骤进行提取，吸取上清液合并至比色管中，定容至刻度线，过0.45μm有机系滤膜，待测。

1.4 叶绿素a的测定

将过滤后的上述溶液置于10mm比色皿中，以90%乙醇溶液作参比，多波长模式下测定750nm、664nm、647nm、630nm处吸光度，并将测试结果代入下式中进行计算。

ρ1为测定试液叶绿素a的质量浓度，mg／L；V1为试样定容体积，mL；V为取样体积，L。

2 结果与讨论

2.1 滤膜冷冻对检测结果的影响

滤膜在-25℃冰箱中冷冻30min与不经过冷冻处理直接提取，对三个不同样品测定结果，测定的结果明显高于直接测定的结果，如表1所示。在显微镜下进行观察，冷冻过的样品细胞破裂更充分，对叶绿素a的提取更完全。

表1 滤膜冷冻对检测结果的影响

2.2 溶剂的选择和温度对叶绿素a的影响

有学者对叶绿素的提取溶剂选择进行研究，提出丙酮作为叶绿素a的提取剂，造成样品中目标物提取不完全，且提取时间过长。该方法提取过程溶剂挥发较快，受人为因素影响也很大，如研磨是否充分，时间是否充足，溶剂较少，洗涤转移效率难以保证等。引进的热乙醇法[6]，90%热乙醇（70℃）与90%丙酮（室温）做萃取剂，取样量为100mL，其余操作同1.3。两种溶剂测定结果及相对标准偏差（RSD）热乙醇法在2.4%～3.8%，丙酮法在5.3%～6.7%，叶绿素a在热乙醇中的溶解度更大，因此提取效率明显较高，精密度更好，见表2。

表2 3个样品两种不同提取溶剂6次重复结果

2.3 匀浆时间、超声波提取时间、提取次数做正交试验进行优化

采用不同的匀浆时间，匀浆时间分别选择2、5、10min，超声波时间分别选择10、20、30min，提取次数分别选择1次，2次，3次（3因素3水平进行正交试验）

表3 乙醇提取正交试验表

从表3中得出：在这3个因素中，超声萃取时间和提取次数显著影响叶绿素a的提取，为主要影响因素，而匀浆时间为次要因素。同等条件下，在超声时间为30 min萃取效果较好；重复提取3次效果较好；综合考虑，这3个因素的最佳组合为匀浆时间为5min，超声时间30 min，提取次数为3次。

3 结论

环保系统普遍采用的叶绿素a的标准方法提取时间长，步骤繁琐，实验人员长时间接触丙酮试剂对身体也有害，而热乙醇法易于操作、毒性低，不仅萃取完全而且重复性好。本文采用滤膜在-25℃低温冰箱中冷冻30min，借助匀浆器和超声波结合破碎藻类植物细胞，使用90%热乙醇（70℃）作为提取溶剂，反复提取3次，大大地提高了叶绿素a的提取效率。本次试验表明，滤膜在-25℃冰箱中冷冻30min冷冻处理，测定的结果明显高于直接测定的结果，在显微镜下进行观察，冷冻过的样品细胞破裂更充分，对叶绿素a的提取更完全；使用热乙醇提取叶绿素a，对比标准方法使用丙酮作为溶剂，叶绿素a在热乙醇中的溶解度更大，提取效率更高，精密度更好；使用热乙醇作溶剂时，正交试验分析了匀浆时间、超声萃取时间、提取次数三因素三水平下的萃取结果，发现匀浆时间为5min，超声时间30 min，提取次数为3次取得的效果最好。