耐热复配酶在再造烟叶生产过程中优化研究

刘恩芬，彭丽娟，陈正春，赵金涛，陈岭峰，赵云燕

（1.云南中烟再造烟叶有限责任公司，云南 昆明 650001；2.云南烟草质量监督检测站，云南 昆明 650001；3.云南中烟新材料有限责公司，云南 昆明 650001）

烟草物料用热水浸泡萃取，经固液分离将烟草水溶物与烟草纤维等不溶物分离，所得纤维在纸机上成型成薄片片基，所得水溶物经蒸馏浓缩，得到烟草提取液，烟草提取液经过基料调配形成涂布液，然后将涂布液液浸涂到片基上，最后干燥得到再造烟叶产品。目前卷烟原料配方中大部分都添加一定经比例的再造烟叶，但再造烟叶存在烟杂气较重、刺激性大、香气降低、烟气柔和度差等缺点。为解决以上问题，从改进萃取技术、优化再造烟叶原料结构，达到提高再造烟叶内在品质。本文通过系统分析再造烟叶加工工艺各工序中物料的关键组分变化，将适应处理工段工艺特性的复配酶解技术引入再造烟叶生产工艺中，对原料进行处理，提高浸提效率，调控化学组分，在提高原料利用率同时提升再造烟叶产品抽吸品质。

近年来，国内外发展了一系列针对烟梗的处理技术，特别是〔1〕基于纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶和蛋白酶的单一性降解作用形成的处理技术，降低烟梗中纤维素、半纤维素、果胶、淀粉和蛋白质等大分子组分物质来改善卷烟吸食品质。生物技术已成为发展最快、应用最广、潜力最大、竟争最为激烈科技领域之一，也是最有希望取得关键性突破的学科之一〔2〕。酶工程是微生物学和工程学相互结合、相互渗透等有机结合而产生的交叉学科，酶作为生物催化剂具有催化专一性好、效率高、作用条件温和等优点，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工、能源、环保、检测等领域，深刻影响着许多重要的科学和实践领域。随着酶学研究的进一步深入，利用酶技术改善烟草品质已经成为烟草行业的热点。吴亦集等[3]研究了在烟梗和烟末萃取过程中加入果胶酶、半纤维素酶和蛋白酶，以及酶添加量、酶解温度和酶解时间对烟末、烟梗中蛋白质、全纤维素和果胶含量及其萃取液中还原糖和氨基酸含量的影响。于兴伟等[4]以黑曲霉h1为菌株，以烟梗为发酵培养基进行固态发酵。Gravely等[5]提出用E.caratavora培养液降解原料中的果胶和用Asetgillus及Aspergnlusoryzae降解烟梗中的纤维素的微生物酶解方法。Gaisch等[6]在烟草水溶液中加入蛋白酶，利用微生物代谢作用降解烟草水溶液中多肽等，此方法处理过的烟草中蛋白质的降解率可达50%以上。Geisis[7]发现同时加入E.caratavora（可以产生果酸酶）和T.Longirrachiatum（可以产生纤维素酶）可降解烟梗中果胶和纤维素，提高再造烟叶内在品质。本项目在不改变现有再造烟叶加工工艺前提下，将适应处理工段工艺特性的耐热复配酶解技术引入再造烟叶生产工艺中，对原料进行高效处理，提高浸提效率，调控化学组分，有效降低再造烟叶加工工艺中的能耗及环境污染，具有重要的经济价值和应用价值。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1）原料：梗原料来自云南中烟再造烟叶有限责任公司。

2）耐热酶：本实验所用高温酶（固体和液体）来自于武汉新华扬，详见表1。

表1 固体单酶技术要求

3）实验试剂及仪器

实验过程中所用到的溶剂和试剂，无特别说明外，均为分析纯，其中用于GC-MS检测相关试剂为色谱纯，实验中用到的小型仪器主要包括pH计（FE20，Mettler Toledo），PCR仪（PCT-0220，Biorad），超纯水仪（CASCADA LSMK2，Pall），电导率仪（FE30，Mettler Toledo），电子天平（PL3002，Mettler Toledo），超低温冰箱（DW-86L828，海尔），分光光度计（UV-1800，Shimadzu），微孔读板机（Molecular Devices SpectraMaxM2e，美国），HPLC（安捷伦，1260）等。

1.2 实验方法

1.2.1 耐热多酶复配体系的开发、优化及应用

利用云南中烟提供烟梗原料，用武汉新华扬生物股份有限公司销售的耐热酶进行筛选和复配研究，形成了五组固体耐热复配酶配方和五组液体耐热复配酶配方，具体配方组分如表2。

表2 固体复配酶配方比例

水和生物酶液量（溶剂）添加量烟梗原料量的7倍，生物酶添加量烟梗原料量的10%。五种耐热复配酶对烟梗进行处理，将二级提取获得的浸提液利用HPLC进行糖分分析，固形物进行组分分析，评价耐热复配酶的作用效果。

1.2.2 多酶复合体系酶解工艺实验操作方法（实验室）

1）测定烟梗物料含水量：称取10g烟梗物料置于玻璃平皿中，70℃烘干至恒重（约4h），称量烘干后物料重量，计算含水量为67.7%。

2）称取烟梗物料31g（相当于10g干物料）置于250mL三角瓶中，三角瓶放在82℃水浴锅中升温。

3）计算溶剂（水+复配酶）量：按照m（溶剂添加量）：m（烟梗） ＝7∶1，计算10g干物料所需溶剂量，称取复配酶，并与一定体积水混合。溶剂放于烧杯中，并在82℃水浴中加热，升温78℃时加入到盛放烟梗物料的三角瓶中，手动搅拌，时间25min。

4）反应结束后，将三角瓶从水浴锅中取出，温度降至室温后取浸出液，残留酶活和利用HPLC主要成分变化。

2 耐热复配酶作用结果与讨论

2.1 还原糖的增加

利用耐热复配酶处理烟梗，烟梗浸提液糖组分结果如表3所示。与对照（不添加酶）相比，添加耐热酶处理实验组浸提液中各种小分子糖含量相对较高，还原糖含量明显增加，原因是耐热复配酶对大分子淀粉和少量纤维素的降解作用。其中TIBLEME6和TIB-LEME9复配酶降解效果相对较好。

表3 复配酶处理烟梗浸提液糖组分分析

2.2 大分子物质的降低

将二级浸提获得的固形物进行干燥，测定主要大分子物蛋白质、淀粉、纤维素和果胶含量变化，如图1。与对照实验相比，五种耐热复配酶处理烟梗后，主要大分子物质蛋白质、淀粉、纤维素、果胶含量都有所降低。蛋白质含量过高，会产生刺激性糊味；淀粉、纤维素含量过高抽吸时一方面会增加焦油含量，产生萘酚等致癌物质，另一方面也会产生刺激、呛咳、烧纸气味；果胶含量过高，烟草香气透发性不良，青杂气较重，产生甲醇、乙酸等刺激气味大分子物质的含量。通过耐热复配酶在加工过中对大分子物质部分降解，在改善梗膏的的同时，提高再造烟叶的吸味质量，降低刺激性，增强烟气香味。

图1 二级浸提图形物大分子物含量变化

2.3 原料梗处理后产品结构变化

五种耐热复配酶处理烟梗后，破坏烟梗结构，使其大分子物质发生变化，测定其纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质、淀粉和果胶含量均有一定变化，说明五种耐热复配酶能够降解烟梗中大分子物质，有助于改善再造烟叶品质。将经过复配酶高温浸提的烟梗进行电镜拍照，如图2所示。经过耐热复配多酶体系处理后，疏松烟梗结构成多孔纤维，提高烟梗烟叶浸提效率，增加再造烟叶的可填充性和燃烧性，使抽吸过程中燃烧相对更充分，降低有害物质的含量。

图2 烟梗二级浸提固形物的显微镜照片

2.4 耐热复配酶处理梗原料致香成份的变化

2.4.1 类胡萝卜素降解产物的变化

类胡萝卜素的降解产物具有明显的致香作用，有利于醇和烟气和增加香气量。由表4看出，在再造烟叶生产过程中，与未经过酶处理获得成品样品相比，经过酶处理获得的成品其类胡萝卜素降解产物含量增加了22.8%；所选的10种类胡萝卜素降解产物中，与对照相比，经酶处理后β-二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮 D、金合欢基丙酮A和金合欢基丙酮B的量都有不同程度地升高，其中β-二氢大马酮增加量为29%，香叶基丙酮增加量为32%，巨豆三烯酮B增加量为35%，巨豆三烯酮D增加量为30%金合欢基丙酮 A增加量为30%，金合欢基丙酮B的量增加的量最多为53%。

表4 类胡萝卜素降解产物的含量变化 μg／g

2.4.2 苯丙氨酸降解产物、西柏烷类降解产物和新植二烯的变化

与未经过酶处理获得成品样品相比，新植二烯的含量明显升高，含量增加了38%（表5），新植二烯是一种C20聚类异戊二烯，在烟草中性挥发物中含量最高，是烟叶中重要的致香物质。该成分是烟叶内含有的叶绿素在成熟和调制过程中降解形成叶醇，再由叶醇进一步脱水而形成的。新植二烯自身具有清香气且刺激性较强，而叶绿素和叶绿醇则具有青杂气。在调制过程中随着叶绿素和叶绿醇大量转化成新植二烯，烟叶的青杂气消除，进而产生清香气。新植二烯在烟草燃烧时可直接进入烟气，具有减少刺激性、醇和烟气的作用。新植二烯作为捕集烟气气溶胶内香气物质的载体，具有携带烟叶中挥发性香气物质和致香成分进入烟气的能力，故又为烟叶的重要增香剂。

表5 西柏烷类降解产物中新植二烯的变化 μg／g

3 结论

1）添加耐热酶处理实验组浸提液中各种小分子糖和还原糖含量相对较高，对大分子糖淀粉和纤维素的降解有明显作用；糖碱比得到了一定的提高，对改善梗丝的香气品质有正面的协调作用，可以使再造烟叶产品燃烧更充分，起到降焦减害的作用。

2）经过耐热复配酶处理过的梗原料，结构更加疏松，产品片基的吸释性增强，有利用增加片基的涂布率，提高再造烟叶的抽吸品质。

3）从香气成分的含量变化可以看出，在酶的催化作用下，物料的香气前体物发生降解、加成和转化等反应，使大分子降解为小分子，复杂结构转化成简单结构，获得较强的致香能力。大部分香气物质的含量增加，各种成分比例更趋协调。这种变化类似与在自然醇化时所经历的化学变化，从而提高了再造烟叶的内在品质和感官质量。