几种化学因素对海蜇毒素溶血活性的稳定效果

李伟　李红　周宇　徐善良

摘 要：为解决在放置一段时间后海蜇（Rhopilema esculentum）毒素溶血活性锐减的问题，利用分光光度计测量了EDTA、GSH、Ca2+、NaCl等化学因素对海蜇毒素溶血活性的稳定效果。结果发现：（1）EDTA对毒素具有较好的稳定作用，浓度在0.5 mmol/L时溶血活性最高，其溶血率为93.63%;（2）NaCl对毒素也具有稳定作用，当浓度在5 mmol/L时溶血活性最高，其溶血率为92.68%;（3）GSH对毒素稳定作用较差，在浓度为0.5 mmol/L时溶血活性最高，其溶血率为58.17%;（4）Ca2+对海蜇毒素不具有稳定作用;（5）正交试验发现，NaCl对溶血活性的稳定性影响最大，在GSH、NaCl、EDTA浓度分别为1.0、5、0 mmol/L时，海蜇毒素的溶血性最强。

关键词：海蜇（Rhopilema esculentum）毒素;溶血活性;化学因素;稳定性

海蜇（Rhopilema esculentum）是一种分布广泛的大型经济浮游动物，隶属于腔肠动物门（Coelenterate），钵水母纲（Scyphozoa），根口水母目（Rhizostomeae），根口水母科（Rhizostomadae），海蜇属（Rhopilema）。海蜇在我国南北沿海均有分布，以黄、渤海及浙江省沿岸分布较多[1-2]。海蜇外部形态由两部分所组成，即伞部和口腕部[3]。在口腕部的边缘处长有触指，又称触手，其多呈乳白色，上面有大量能放出刺丝的囊状细胞器—刺胞，刺胞内含有大量的毒液，这些毒液称为海蜇毒素[4-5]。当海蜇的触手刺入人体皮肤，会迅速释放刺胞毒中的毒素引发皮肤搔痒、水肿、肌痛、呼吸困难、低血压、休克甚至死亡等现象[6]。海蜇不仅具有食用价值，还是一种具有特殊功效的中药材[7]，海蜇毒素在现代医学上具有降压、降脂、抗氧化等作用[8]。

在洪惠馨[9]、Nagai H[10]等的研究中发现，海蜇毒素的主要成分为类蛋白、多肽、酶类毒素、四氨铬物、强麻醉剂、组织胺、5-羟色胺等生物活性物质，同时还发现毒素发挥溶血作用主要是以相关物质对细胞膜上的离子通道、离子泵和通透性蛋白产生影响来实现的[11-12]。但是海蜇毒素在放置一段时间后活性会发生锐减。为了解决这一问题，本试验通过研究几种不同的化学因素对海蜇毒素溶血活性的影响，从而对海蜇毒素的保存条件进行优化，进而有利于将来对海蜇毒素的溶血活性物质、毒理作用和药理作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 刺丝囊的分离

试验用海蜇于2016年8月下旬采集于浙江省宁波市鄞州区一海蜇养殖场。从海蜇养殖场采集新鲜活体海蜇运送到实验室后，使用人工手术刀片切下触手，并用生理盐水冲洗后迅速于-20 ℃冰箱冷冻保存。需要海蜇时将一部分先前保存的海蜇触手取出，置于约四倍体积的无菌海水中，在4 ℃温度下使其发生自溶，可每天用玻璃棒轻搅2～3次并进行换水加快自溶。五天后，倒掉上层清液，利用100目的滤筛过滤下层悬浊液，滤除未溶解的组织。滤液离心后收集沉淀，将沉淀重新悬浮于0.9% NaCl溶液中，在10 000 r/min的转速下离心20 min。离心完毕后将上清液倒掉，用小勺轻轻刮去离心管中的沉淀上层（大部分为破碎的刺丝囊和触手组织碎片），再将剩余的底层沉淀重新悬浮于0.9% NaCl溶液中，在10 000 r/min的转速下离心，每30 s取刺丝囊观察一次，直至显微镜下观察到刺丝囊表面没有杂质为止。将沉淀重新吹悬于0.9% NaCl溶液中，在5 000 r/min的转速离心15 min，并用蒸馏水洗涤沉淀3～4次，冷冻后干燥，于-20 ℃冰箱保存[13]。

1.2 海蜇毒素的提取

本试验中海蜇毒素的提取采用珠磨式组织研磨法。具体方法为：将直径约为0.5 mm的玻璃珠和上一步中提取的刺丝囊加入小型破碎管中，加入的玻璃球和刺丝囊的体积约占破碎管总体积的一半，然后用等渗的Tris-HCl缓冲液浸没。放置于4 ℃的冰箱内预冷1 min后，于4 600 r/min下震荡破碎1 min，重复几次后，将破碎液转移到离心管中，在10 000 r/min，4 ℃条件下冷冻离心20 min，对离心后的上清液进行收集，所得的上清液即海蜇毒素溶液[14-15]。

1.3 红细胞溶液的制备

用Tris-HCl的等渗缓冲液（pH为7.4）和肝素（约为160单位/mg）配制为一定量的肝素Tris-HCl等渗缓冲液，采新鲜鸡血于容器中并加入抗凝剂，按照肝素Tris-HCl缓冲液与血液之比为1∶5的比例加入适量肝素Tris-HCl缓冲液。然后血液在4 ℃，2 000 r/min的条件下离心20 min。得到红细胞沉淀。将上清液（即血浆）倒掉，并除去红细胞沉淀表面的绒毛状沉淀层，然后用三倍量的预冷的Tris-HCl缓冲液将红细胞悬浮，后4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃去上清液，刮去表层沉淀，如此重复洗涤三次，最终得到红细胞沉淀。试验时将红细胞沉淀配成体积比为1% 的溶液备用[16]。

1.4 不同物质对海蜇毒素稳定性的影响试验

试验分为5个组，每组设置3个平行，第一组用Tris-HCl缓冲液配置一定量的EDTA，使其浓度为5 mmol/L，加入到毒素溶液中，使毒素溶液中的EDTA的浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;第二组取一定量的NaCl用Tris-HCl缓冲液配置成50 mmol/L，加入毒素溶液中，使得其中的NaCl浓度分别为0、1.0、5.0、15、20、25 mmol/L;第三组取一定量的CaCl2用Tris-HCl缓冲液配置成25 mmol/L，加入毒素溶液中，使得其中的CaCl2浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L;第四组用Tris-HCl缓冲液将一定量的GSH（还原型谷胱甘肽）配制成浓度为25 mmol/L的溶液，取适量GSH溶液加入毒素溶液，使毒素溶液中GSH的濃度分别达到0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;第五组为三因素四水平试验（表1）。

1.5 溶血活性的测定

本试验中测定海蜇毒素溶血活性的方法参考了Rottini[17]。测定海蜇毒素的溶血活性时取0.5 mL第三步中制得的红细胞悬浊液，加入等体积的各个毒素样品，再用等渗Tris-HCl缓冲液（pH为7.4）配至总体积为2 mL，用414 nm的紫外光测定各样品上清液的吸光值，所得的数据即可代表溶血活性。

1.6 数据处理

将得到的数据通过SPSS13.0、EXCEL等工具进行分析，最终通过平均值±SD的方式进行表示，采用SPSS中单因子方差分析（One-way Anova）的Duncans multiple法对溶血活性进行差异显著性检验（P<0.05为差异性显著），并进行作图。

2 结果与分析

2.1 EDTA对海蜇毒素溶血性的影响

试验发现，毒素中加入一定量的EDTA对于毒素稳定性的增强具有一定的作用。试验结果如图1所示，未加入EDTA（即EDTA的浓度为0时）的海蜇毒素样品的溶血活性为87.60%，当海蜇毒素中EDTA浓度上升至0.5 mmol/L时其溶血能力达到了最大值93.63%。随着毒素中EDTA浓度的逐渐增大，溶血能力呈现先降低再升高的现象，但均高于未添加EDTA时海蜇毒素的溶血能力。经过显著性分析发现，各浓度下的溶血性无显著性差异。

2.2 NaCl对海蜇毒素溶血性的影响

试验发现，毒素中加入一定量的NaCl能够在一定程度上稳定海蜇毒素溶血活性。试验结果如图2所示，当海蜇毒素中NaCl浓度为0 mmol/L的时候，其溶血能力为77.51%。随着NaCl的浓度增加，溶血能力也开始逐渐增强，当毒素中的NaCl浓度达到5 mmol/L时，溶血能力达到最大值92.68%;当浓度高于5 mmol/L后，毒素的溶血能力又开始下降，在浓度从5 mmol/L上升至15 mmol/L这个过程中，毒素的溶血能力也下降至78.59%;在浓度高于15 mmol/L后溶血能力下降缓慢;当浓度达到20 mmol/L后，溶血活性趋于平稳，略高于未加入NaCl的毒素的溶血活性，说明此后NaCl对于溶血活性影响不大。同时，通过显著性分析发现，在NaCl浓度从0 mmol/L增加到1 mmol/L时，溶血活性显著性增强，在浓度为1、5、10 mmol/L这三组间溶血活性具有差异性，但没有显著性增强或减弱，同时，在浓度从10 mmol/L变为15 mmol/L时，出现显著性降低，浓度继续增加，显著性差异变小。

2.3 Ca2+对海蜇毒素溶血性的影响

试验发现，毒素中加入一定量CaCl2后，海蜇毒素的溶血性基本不随浓度的变化而变化，结果如图3所示，基本保持在44.50%左右，整体趋于平稳，说明CaCl2对海蜇毒素的溶血活性基本不具有稳定性的作用。通过显著性分析也发现，各浓度下的溶血活性有一定的差异性，但是各组间差异性较小，整体溶血活性较为稳定。

2.4 GSH对海蜇毒素溶血性的影响

试验发现，毒素中加入一定量的GSH能够在一定程度上稳定海蜇毒素溶血活性。结果如图4所示，发现未加入GSH的海蜇毒素溶血水平为43.17%，然后随着浓度的增加，溶血活性也逐渐增强，在浓度为0.5 mmol/L时，溶血能力达到最大值58.17%，但随着浓度的继续增大，溶血活性开始逐渐减弱，最终趋于平稳，但溶血活性均比未加入GSH的几个组高。同时，通过显著性分析发现，GSH浓度从0 mmol/L增加到0.5 mmol/L时，海蜇毒素的溶血活性有显著性增强，其溶血活性在GSH浓度为0.5～1.0 mmol/L以内时具有差异性，但没有显著性增强或减弱。在浓度从1 mmol/L变为1.5 mmol/L时，出现显著性降低，之后浓度继续增加，显著性差异变小。

2.5 正交试验

试验发现，一定量的EDTA、GSH、NaCl对海蜇毒素的溶血活性均具有一定的稳定作用，故设计三因素四水平试验，从而得到使得海蜇毒素保持相对稳定的最佳的条件。见表1。

3 讨论

海蜇毒素中含有与溶血活性相关的成分，海蜇毒素活性检测的最好方法就是溶血活性检测。按照相关报道，有关毒素在红细胞中发生溶血作用主要通过以下三个步骤：（1）毒素通过温度依赖性附着的方式附着于细胞膜上;（2）毒素通过温度依赖性的方式穿透细胞膜，形成细胞膜空洞;（3）细胞破裂，血细胞内血红蛋白释放至外界[18]。冯金华[19]等的实验发现水母毒素在4 ℃的条件下是不具有溶血活性的，但是升温后活性可以得到恢复，所以选择先在4 ℃的条件下进行海蜇毒素的提取。

通过正交试验发现，不添加任何物质时，海蜇毒素的溶血活性最低，当GSH、NaCl、EDTA浓度分别为1.0、5.0、0 mmol/L的时候，其溶血活性最高。见表2。

GSH是一种小分子肽类物质，其分子结构中一般含有巯基，巯基有一定的解毒作用，因其可以与汞、铅等的重金属盐形成络合物而减少重金属盐与其他物质的结合，即中和毒性。解毒的同时，GSH也对蛋白质及酶分子中的巯基有保护作用，可避免其被自由基氧化而活性丧失。GSH能够在一定程度上稳定海蜇毒素的溶血活性，可能与海蜇毒素中相关酶或蛋白质的活性中心中含有巯基有一定的关联。

蛋白质类酶的活性在很大程度上受金属离子的影响，因金属离子可以作为酶分子的辅助因子，对酶的活性及专一性产生影响。同时有些金属离子会起活化剂的作用，如Co2+、Mn2+、Mg2+等离子一般能使D-葡萄糖异构酶的活性显著增加[20]。金属激活酶中的酶主要与金属离子进行松弛的结合，对酶结构的稳定性产生一定的影响，如Ca2+对胰蛋白酶、灰色链丝菌蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等酶具有稳定性[20]。相关研究发现，有Ca2+存在时霞水母（Cyanea sp.）毒素的溶血活性有所增强但没有稳定毒素作用[21]，本研究发现，Ca2+对海蜇毒素的溶血活性不具有增強和稳定的作用，故推测Ca2+可能只是海蜇毒素溶血物质中的一个起到催化作用的金属离子，不是海蜇毒素活性成分的特异性配基。

对于大多数蛋白质来说，保存在一定离子浓度的溶液中有利于蛋白质在溶液中形成非天然聚集物，因为溶液中的离子会对蛋白质中分子间电荷的相互作用产生一定的屏蔽效果[20]。据报道，Carbdea rastoni水母毒素在4 ℃下，在0.8 mol/L NaCl、5 mmol/L 磷酸缓冲液中可以保持6个月的溶血活性[22]。本试验中，加入的NaCl也对海蜇毒素溶血活性具有一定的稳定作用。

EDTA是一种螯合剂，能与金属离子发生螯合作用，从而使得相关金属离子不能作为蛋白质氧化的催化剂与海蜇毒素结合。适量的EDTA加入溶液中可以结合溶液中的重金属 （如Fe、Cu、Mn等），防止相关活性蛋白质与重金属结合发生失活的现象[21]。所以将少量的EDTA加入到毒素中，可能是对毒素的保护产生了有利影响，使毒素活性得以保持。EDTA所发挥的作用与GSH 的作用是相似的，故在正交试验中，在只含有5.0 mmol/L NaCl、1.0 mmol/L GSH的溶液中，海蜇毒素也可达到较大的溶血活性。

本试验通过研究GSH、Ca2+、NaCl、EDTA等化学因素对海蜇毒素溶血性稳定性的影响，表明Ca2+对海蜇毒素的溶血性基本没有稳定作用，GSH、NaCl、EDTA等均对海蜇毒素的溶血活性的稳定性具有一定的作用，其中NaCl的稳定作用相对较强。同时，通过显著性差异分析，也可以发现在低浓度下浓度越大稳定性效果越好，高浓度的稳定效果差异性不大，其稳定效果都表现得较差。当毒素中GSH浓度为1.0 mmol/L、NaCl浓度为5 mmol/L时，海蜇毒素溶血性最高，即稳定效果最佳。同时通过与冯金华[21]等人对于霞水母毒素研究的对照，可以发现，两者的刺丝囊毒素溶血性的稳定性受GSH、NaCl、EDTA等单因素影响大致相同，都是在低浓度时随影响物质浓度的增大而具有更好的稳定效果，当影响物质达到一定浓度后若浓度再继续增加，其稳定效果开始下降，在达到较高浓度后，对毒素的溶血活性的稳定效果趋于稳定，不再随浓度变化而变化;Ca2+基本上对两种毒素的溶血活性都没有稳定作用;在正交试验时发现，影响霞水母刺丝囊毒素溶血性的稳定性的主要因素是GSH，而影响海蜇刺丝囊毒素的则是NaCl，这可能是由于种类的差异造成的，也可能是因为试验时冷冻保存时间的不同而造成的， 但可以发现在各组正交中两者溶血性变化趋势是相一致的，稳定效果的最佳结果也是相同的。两者对比，可以说明海蜇毒素受化学条件的影响与霞水母毒素受到的影响是大致相同的，但是由于种类差别，两者在溶血能力上有一定的差异。

4 结论

本试验进行了海蜇毒素的提取，并研究了GSH、Ca2+、NaCl、EDTA等化学因素对海蜇毒素稳定性的影响，结果表明，GSH、NaCl、EDTA可以对海蜇毒素的稳定性具有一定的影响，而Ca2+可能仅作为催化剂，对海蜇毒素溶血活性的稳定性无影响。当毒素溶液中含有0 mmol/L EDTA、5.0 mmol/L NaCl和1.0 mmol/L GSH时，可获得对溶血活性最佳的稳定作用。通过本次研究，得到了效果较优的稳定海蜇毒素的方案，为今后进一步进行海蜇毒素的相关研究奠定了基础。

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The stabilizing effect of several chemical factors on the hemolytic activity of jellyfish toxin

LI Wei1，LI Hong1，ZHOU Yu1，XU Shanliang1，2*

（1.School of Marine Sciences， Ningbo University; Ningbo 315211，China;2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology Ministry of Education， Ningbo University， Ningbo 315211，China）

Abstract：In order to solve the problem that the hemolytic activity of jellyfish（Rhopilema esculentum） toxin decreases sharply after being placed for a period of time， the stabilizing effect of chemical factors such as EDTA， GSH， Ca2+ and NaCl on the hemolytic activity of jellyfish toxin was measured by spectrophotometer. The results indicated that： （1） The presence of EDTA benefited the stability of the hemolytic activity. The hemolytic activity was the highest when the concentration was 0.5 mmol/L， and its hemolysis rate was 93.63%. （2） NaCl also had a stabilizing effect on the toxin. When the concentration was 5 mmol/L， the hemolytic activity was the highest and the hemolysis rate was 92.68%. （3） GSH had a poor stabilizing effect on the toxin. The hemolytic activity was the highest when the concentration was 0.5 mmol/L， and its hemolysis rate was 58.17%.（4） The results showed that Ca2+ had no stabilizing effect on jellyfish toxin. （5） Orthogonal experiment found that NaCl had the greatest influence on the stability of hemolytic activity. When the concentrations of GSH， NaCl， and EDTA were 1.0， 5， and 0 mmol/L，respectively， the hemolysis of jellyfish toxin is the strongest.

Key words：jellyfish（Rhopilema esculentum） toxin; hemolytic activity; chemical factor; stability

（收稿日期：2020-08-19;修回日期：2020-09-11）

基金項目：浙江省重大科技专项项目（2019C02059）。

作者简介：李伟（2000.03-），男，本科在读，专业：水产养殖。E-mail： 186003051@nbu.edu.cn。

通信作者：徐善良（1962-），男，教授，研究方向：海产经济动物健康养殖。E-mail： xushanliang@nbu.edu.cn。