金属阳离子对膝沟藻毒素适配体（GO18-T-d）G四联体结构的影响

章琪，刘建平

（复旦大学生命科学学院，上海 200438）

G四联体适配体独特的结构使其成为了理想的生物传感器报告基团，其中膝沟藻毒素适配体（GO18-T-d）则是典型的G四联体核酸分子，能够特异性作用于膝沟藻毒素分子结合从而达到检测目的[1]，但是其G四联体结构易受到金属阳离子的影响。由于G四联体平面的4个鸟嘌呤羰基上都具有一个带负电的氧原子，这4个氧原子排列于一个平面形成一个口袋，在金属阳离子的诱导下，不同G四联体平面通过π-π堆积形成一个稳定的多平面结构。因此，不同的金属阳离子对G四联体结构稳定性的影响各不相同。本研究旨在探索适配体GO18-T-d的G四联体结构在不同金属阳离子如K+、Na+、Mg2+下的稳定性强弱，评价不同金属阳离子对其G四联体结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验中所用的DNA、KCl、NaCl、MgCl2·6H2O由生工生物工程股份有限公司生产，Tris购于国药集团化学试剂有限公司，0.2 μm水相过滤膜购于上海安谱实验科技股份有限公司。

G四联体组成碱基由G四联体打分软件QGRS Mapper预测完成[2]，G四联体拓扑结构模型由核酸三维结构可视化建模网站3D-Nus的G-Quadruplex模块构建[3]，适配体全原子结构模型由结构可视化软件VMD构建完成。分子动力学模拟Gromacs5.1.4软件中进行。

1.2 试验方法

1.2.1 圆二色谱实验

实验中所用的缓冲体系为20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5，共设计了3种不同离子的缓冲液，分别为10 mmol/L KCl、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2。制备2×buffer以供后续实验所用。Nanodrop 2000测量核酸浓度后，利用buffer将核酸稀释至10 μmol/L的浓度，将核酸样品于95 ℃加热10 min，再以2 ℃/min的速度降温至室温。圆二色光谱波长测量范围为220～360 nm，检测温度25 ℃，扫描速度120 nm/min，重复扫描3次后取平均值。

1.2.2 分子动力学模拟

分子动力学模拟在Gromacs5.1.4软件中进行，力场为AMBER99 bsc1力场[4]，采用SPC水模型建模；模型建立后，在体系中插入相应离子以达到所需的离子浓度；恒温和升温过程由Gromacs5.1.4的模拟退火模块完成。模拟体系搭建完成后，进行不同体系的核酸全长三维结构模型的分子动力学模拟，模拟时间为20 ns。前10 ns体系温度为293 K，随后每个体系的模拟温度从293 K升高到693 K。

2 结果与分析

2.1 GO18-T-d适配体G四联体拓扑构型的解析

圆二色谱实验测得的适配体GO18-T-d圆二色谱图如图1所示。不同离子缓冲液下的适配体GO18-T-d均在270 nm处有一个正向吸收峰，而在240 nm处有一个负向吸收峰，而对照组（序列为5'-TCACGAACTTCATTAACTGACTTAC-3'，非G 四联体序列）在250 nm处有一个负向吸收峰，在280 nm处有一个正向吸收峰。这一实验结果说明对照组适配体为非G四联体结构，与其适配体序列相符，而适配体GO18-T-d在不同离子条件下均能形成平行式G四联体结构；且不同离子条件下，适配体正峰峰值大小顺序为K+＞Na+＞Mg2+，说明在K+的诱导下，适配体GO18-T-d形成G四联体的比例高于Na+，Na+则高于Mg2+。

图1 不同离子条件下适配体GO18-T-d圆二色谱特征吸收曲线图

2.2 GO18-T-d适配体结构模型的构建

在确认适配体GO18-T-d的拓扑结构后，利用G四联体预测方法，成功获取了该适配体的三位全原子结构模型，结果如图2所示。

图2 不同离子条件下适配体GO18-T-d三维结构模型图

2.3 不同离子条件下适配体结构稳定性评价

在获得适配体GO18-T-d的3种不同离子条件下的三维全原子模型后，对其进行分子动力学模拟，结果如图3所示。适配体在K+条件下，其G四联体结构RMSD波动最小，组成G四联体的Hoogsteen氢键数量维持在16个左右，热稳定性最高；Na+次之，Mg2+条件下，适配体G四联体结构热稳定性最低。这一结果同时也验证了圆二色谱实验中，K+下适配体GO18-T-d的正向吸收峰值高于Na+，Na+下适配体GO18-T-d的正向吸收峰值高于Mg2+的结果。

图3 GO18-T-d适配体G四联体结构RMSD及Hoogsteen数目变化统计图

3 结论

K+在稳定GO18-T-d适配体G四联体结构方面的作用高于Na+和Mg2+，为构建合理的适配体（GO18-T-d）缓冲体系提供了一定的理论支持，同时也提示了不同金属离子对核酸G四联体结构的影响，为G四联体生物传感器的开发与检测提供了一定的基础。