给水管网中水流流速对生物膜形成的影响

单蓉蓉，章鑫鑫，余超，鲁新珠

（合肥工业大学土木与水利工程学院，安徽合肥 230009）

由于用户用水量的动态变化，给水管网中水流流速也在不断变化。水动力条件（流速、剪切力以及水力停留时间等）决定了营养物质、消毒剂和悬浮颗粒物的迁移和分布，同时也控制了微生物的一系列功能。研究表明，流态会影响营养物质及氧气的传输[1]，从而影响细胞生长速率；流速越大剪切力就会越高，高剪切力可能导致生物膜脱落[2]。不仅如此，水动力改变也会影响胞外聚合物的分泌，高剪切力促进胞外多糖的分泌，进而调控微生物在其表面附着的同时起到保护屏障的作用。尽管如此，目前有关给水管网中流速对生物膜的形成还存在很多不清晰的地方。本实验以自来水中的细菌为研究对象，通过构建动态模拟装置试验平台，借助于活死细胞染色、Lowry蛋白法、硫酸蒽酮法等分析方法来观测生物膜上的生物量及胞外聚合物，剖析流速对生物膜的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

LIVE/DEAD染 液[SYTO 9染 料0.33 mmol/L、碘化丙啶（PI）2 mmol/L]，赛默飞世尔科技；硫酸、蒽酮，分析纯，国药集团；Lorry低蛋白试剂，0.1～50 μg/mL，荔达公司；0.9%生理盐水，国药集团。

TH4-200荧光显微镜，日本奥林巴斯；MS-2000激光粒度分析仪，英国Malvern；UV2006紫外分光光度计，上海尤尼科。

1.2 实验设置

研究流速对给水管网生物膜的影响，水样取自市政给水管网，放置于3 000 mL锥形瓶中，四台蠕动泵同时进行，采用外径×内径为6 mm×4.8 mm的PE管道，在封闭室温条件下完成。实验设置4个流速，分别是0.0 m/s、0.3 m/s、0.7 m/s和1.0 m/s。实验前用最大流速以蒸馏水冲洗3次[3]，实验进行过程中采用调整蠕动泵的转速进行流速的控制。各实验装置取样时间点为6 h、24 h、48 h、120 h及144h。实验的取样点选择管网末端，在各时间点剪下2.0 cm管段。将剪下的管段放置于10 mL生理盐水中震荡悬浮用于管壁生物膜相关实验参数的测试。

1.3 微生物的提取

将剪下来管段的外部用70%的酒精擦拭消毒，管段内部先用生理盐水洗去管壁上悬浮的细菌，然后用消毒棉签在管段内部擦拭5～10次，再将棉签放入10 mL生理盐水中，手摇30 s后在频率为47 kHz超声清洗仪超声2 min[4]，将管壁生物膜融入生理盐水中。管壁生物膜菌悬液用于细菌计数、胞外聚合物（多糖和蛋白）测定等。

1.4 细菌量的测定

细菌量的测定通过分子探针LIVE/DEAD细菌活性试剂盒来测定。具体操作过程为：取3 μL PI和3 μL SYTO 9加入5.0 mL样品中，在室内避光染色30 min，将染色后的样品通过直径为25 mm、孔径为0.22 μm的黑色聚碳酸酯膜，在荧光显微镜下进行观察和拍照，在一定倍数下对同一样品随机拍摄10张照片，记录细菌数。

1.5 胞外聚合物的提取及测定

采用加热法对胞外聚合物进行提取。具体操作过程为：取15 mL样品，加入生理盐水，80 ℃水浴加热60 min，蒸发至体积为15 mL，再通过0.22 μm滤膜过滤，滤液即为待测溶液。测定多糖（PS）浓度采用蒽酮法，用葡萄糖作标准曲线，在625 nm波长下用紫外分光光度计测定各个待测液的分光光度值[5]；测定蛋白（PN）浓度采用Folin-Lowry法，用牛蛋白血清作标准曲线，在750 nm波长下用紫外分光光度计测定各个待测液的分光光度值[5]。

1.6 Zeta电位的测定

测定水中悬浮细菌的Zeta电势，利用MS-2000激光粒度分析仪进行测定，并利用分散技术软件进行读数。具体操作过程如下：摇匀细菌悬浮液，取750 μL样品注入样品池中，盖上盖子测定读数。

2 结果与分析

2.1 流速对生物膜上生物量的影响

图1为不同流速下生物膜上生物量的变化。在6 h时，流速从0 m/s增加至0.7 m/s，生物量从（8.4±2.1）×105cells/cm2增加到（14.5±3.3）×105cells/cm2；流速继续增加至1.0 m/s，又导致生物量降低为（6.8±1.4）×105cells/cm2。随着时间推移，生物量随流速的变化是一致的，均是先增加后减小，在0.7 m/s达到峰值。在144 h时，0.7 m/s下的生物量达到（32.3±2.9）×105cells/cm2。适量的流速可以促进营养物质及氧气传输加快生物膜生长，而剪切力过大又会导致生物膜脱落到水中。

图1 不同流速下生物膜上生物量随时间的变化

2.2 水流流速对管壁及溶液中微生物胞外聚合物分泌的影响

图2显示了胞外聚合物含量随流速的变化。6 h时，多糖和蛋白含量从0 m/s的（0.5±0.1）μg/cm2、（0.9±0.2）μg/cm2增加至0.7 m/s的（0.9±0.1）μg/cm2、（1.1±0.2）μg/cm2，随后在1.0 m/s又降低为（0.8±0.1）μg/cm2、（1.1±0.2）μg/cm2，在 0.7 m/s达到峰值。24 h到144 h，胞外聚合物增长模式一致，且分泌量越来越多。144 h后，0.7 m/s时多糖和蛋白增加到（2.2±0.5）μg/cm2、（1.3±0.2）μg/cm2。在水流剪切力胁迫下，细菌会分泌更多的胞外聚合物，形成保护膜来躲避恶劣环境的伤害；而剪切力过大又会导致细胞活性降低，胞外聚合物分泌量减少。

图2 不同流速下生物膜上胞外聚合物分泌随时间的变化

2.3 Zeta电位分析

图3描述了主体水中Zeta电位的变化。据研究，Zeta电位绝对值越低，代表胶体稳定性越低。从6 h至144 h，Zeta电位绝对值越来越大，胶体逐渐趋于稳定。144 h后，流速从0 m/s增加至0.7 m/s，Zeta电位从（-15.1±0.8）mV减少至（-12.7±0.6）mV，流速继续增大至1.0 m/s，电位又增加到（-14.1±2.2）mV。将Zeta电位与胞外聚合物的含量进行比较，发现Zeta电位与胞外聚合物和生物量成反比，说明胶体的不稳定会促进细菌向载体表面附着。

图3 不同流速下Zeta电位随时间的变化

3 结论

适当大小流速可以促进生物膜上细菌生长和胞外聚合物分泌，高剪切力又会抑制生物膜生长。0.7 m/s主体水中，胶体最不稳定，有利于细菌向载体表面附着。

目前对环境压力下细菌增长机理方面的研究还不够完善，仍有很多问题值得进一步去探索。结合本次所做的研究，还可以在以下方面进一步探索：

（1）本文的流速为恒定流速，而实际给水管网中的流速是波动的，波动流速对管网中细菌增长可能会有更大的影响，可以进一步去研究；

（2）本文对管网中生物膜的研究比较浅，只观察到现象的变化，其中的机理并不清楚，可以通过建立模型或纯种实验进行更深入的研究剖析其中的机理。