营养物质对希瓦氏菌附着行为的影响

沈仁豪，贾伟，张瑾

（合肥工业大学土木与水利工程学院，安徽合肥 230009）

生物膜与人们的生活息息相关，在食品加工中，生物膜会附着于金属设备与金属管道表面，其代谢活动很容易让食品生产过程中出现污染，最终引发食源性疾病[1]；此外，生物膜可以附着在工业热交换系统、通风设备、自来水管道、医疗器械、病理状态下的人体器官表面等。20世纪70年代，Costerton等[2]首次提出了细菌生物膜的概念，发现在许多环境之中都存在着生物膜形态的细菌，比浮游细菌的数量更多，物体表面的细菌更是99.9%都以生物膜的形式存在。生物膜的存在，给食品、医疗、卫生等各个方面都带来了巨大损失，然而在污水处理等领域中，生物膜又可以承担着处理污废水和转换能源的重要角色。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种Shewanella. Oneidensis MR-1由中国农业大学资源与环境学院实验室提供，菌种号1A01706。

LB培养基，奥博星；乳酸钠溶液，分析纯，国药集团；无机富营养液（氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾），分析纯，国药集团；亲、疏水碳纸，北京晶龙特碳科技有限公司；吖啶橙染色液，南京亿讯生物科技有限公司；黑色聚碳酸酯滤膜，上海力敏实业有限公司。

Centrifuge5804高速离心机，美国Eppendorf；UV2600紫外分光光度计，上海Unico；TH4-200高效液相色谱仪，美国Agilent；IX73+DP倒置显微镜，日本Olympus；DNP-9162.1A电热恒温培养箱，上海三发；I型扁平毛细玻璃管（0.30 mm×0.03 mm），Electron Microscopy Sciences，USA。

1.2 实验设置

取30个放入电极的试剂瓶，放入高压灭菌锅内121 ℃条件下灭菌15 min后，分别配置浓度梯度为 50.000 mmol/L、25.000 mmol/L、12.500 mmol/L、1.250 mmol/L、0.125 mmol/L和0 mmol/L的乳酸钠溶液（其中已包含无机富营养液），将待加入的无机富营养液放入高压灭菌锅内121 ℃条件下灭菌15 min后，再各取40 mL加入各个试剂瓶中。将配置好的希瓦氏菌定量至4.35×108cells/mL数量级（OD值≈0.55）10 mL加入各反应瓶中，相当于浓度梯度为 40mmol/L、20 mmol/L、10 mmol/L、1 mmol/L、0 mmol/L的乳酸钠溶液。每个实验设置3组平行样，按照20 min和8 h取样分析，每次取样2 mL。实验在温度为（30±1）℃的恒温培养箱中进行。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌数的测定

细菌生物量由紫外分光光度计以及吖啶橙荧光染色计数法确定，其中吖啶橙染色方法为：取适宜浓度的细菌悬液5 mL，加入0.01%吖啶橙染色液使其占总混合液的5%，混匀后避光静置染色30 min[3]。为尽量避光以防荧光淬灭，在暗室条件下将经过吖啶橙染色的菌液滤过孔径为0.22 μm的黑色聚碳酸酯滤膜。过滤后取出滤膜，固定在载玻片上，通过荧光显微镜在一定倍数的视野下观察，随机选取至少10个视野，统计细菌数量，再通过视野面积和滤膜面积之比算出菌液中细菌生物量[4]。该菌液统计出的生物量与菌液在波长为600 nm的分光光度计下测得的吸光度形成对应关系，分别测得不同生物量的菌液，绘制标准曲线。实验中所得的样品通过测得吸光度后参照标准曲线从而得到细菌的生物量。

1.3.2 运动速度测定与统计方法

在试剂瓶中取2 mL溶液，使用I型扁平毛细玻璃管提取细菌液，在显微镜下进行观察并录像，分辨率设为800×600，感光度设为ISO 100[5]。

每一组样品拍摄一段视频，每个视频时长2 min，后续速度分析使用Image J软件中的Manual tracking插件进行细胞追踪，使用PotPlayer软件对录像视频进行间隔为0.5 s的截图以记录细菌位置的变化情况，后将截取的序列照片导入Image J中，打开manual tracking插件并作如下设置：Time interveral设为0.50 s，x/y calibration为其相对应像素长度值。点击Add track按钮后手动追踪细胞并进行位置标识，直至序列结束。导出表格中数据并在Excel软件中进行数据分析。分别统计细菌在实验开始后20 min和8 h的运动速度。每个时间点取视频中5个细菌的运动轨迹平均进行分析，每个细菌统计其15 s时间中运动30个点的平均运动速度。

如公式1所示，采用正态分布（Gauss Amp公式）对速度频率进行非线性拟合。

其中，xc为模拟的期望值，y0为曲线底部高度，A为xc对应的曲线高度。

1.3.3 乳酸钠吸附浓度的计算

先各取 1 mL浓度为 80 mmol/L、40 mmol/L、20 mmol/L、10 mmol/L和1 mmol/L的乳酸钠溶液于液相瓶中，用高效液相色谱仪测得峰面积，与其对应的浓度绘出乳酸钠的标准曲线。再将相应时间段得到的不同浓度下实验样品各取1 mL，测定乳酸钠在溶液中的剩余量，用原有量减去剩余量就可以得到乳酸钠的减少量。

2 结果与分析

2.1 细菌附着量

碳纸表面希瓦氏菌附着量如图1所示，可以看出亲水碳纸的希瓦氏菌附着量远多于疏水碳纸。在初期附着阶段（20 min），亲水、疏水碳毡细菌附着量均在1 mmol/L乳酸钠浓度下达到峰值，分别为（9.33±0.92）×107cells/cm2和（1.85±1.33）×107cells/cm2。随着乳酸钠浓度的提高，希瓦氏菌附着量呈现先增加后减小的规律。

培养到8 h时，疏水碳毡没有显著的规律性，而亲水碳毡呈现出随着乳酸钠浓度的提高，附着量增加的规律。说明贫营养浓度在初期附着阶段可以促进希瓦氏菌的附着，但随着时间推移，营养浓度的匮乏将满足不了细菌的生长繁殖需求。

2.2 碳纸表面乳酸钠吸附情况

实验初始阶段，碳纸表面乳酸钠吸附情况如图2所示，吸附率为碳纸表面吸附的乳酸钠浓度所占溶液中整体乳酸钠浓度的比重。

图1 碳纸上细菌附着量

溶液中营养物质浓度对于亲水碳纸吸附乳酸钠浓度影响显著（单因素方差分析P＜0.01），亲水碳纸上的乳酸钠溶液吸附率在1 mmol/L乳酸钠浓度条件下最多，这可能是贫营养浓度下可以促进希瓦氏菌附着的原因之一。而溶液中的营养物质浓度对于疏水碳纸吸附乳酸钠浓度的影响并不显著，且疏水碳纸上的乳酸钠吸附率极低，这也是疏水碳纸上希瓦氏菌附着量远低于亲水碳纸的原因。

2.3 营养物质对细菌运动速度的影响

希瓦氏菌的运动速度期望值如图3所示，溶液中的营养物质浓度对于希瓦氏菌运动速度影响显著（单因素方差分析P＜0.01）。可以看到在初期附着阶段，细菌的运动速度随乳酸钠浓度的增大呈现先增大后减小的趋势，在乳酸钠浓度为1 mmol/L时达到最大值，为（5.97±0.22）μm/s，这种规律与初期附着规律相似，细菌会趋向于对自己生存有利的生存环境中。

在8 h时，细菌运动速度随着营养物质浓度升高而上升，在40 mmol/L乳酸钠浓度下达到运动速度最大值，为（5.32±0.35）μm/s。说明在初期附着过程结束后，营养物质匮乏将影响希瓦氏菌的运动性。

图3 细菌运动速度期望

3 结论

（1）贫营养浓度可以有效促进希瓦氏菌的初期附着，从亲水、疏水碳纸的对照实验中可以看出，碳纸上营养物质的吸附率是导致这一现象出现的关键因素。

（2）贫营养浓度可以有效提高希瓦氏菌的初期运动速度，提高其与碳纸的碰撞概率，这是促进初期附着的因素之一。

（3）贫营养浓度对于细菌附着的促进作用随着时间的推移会显著下降。