中华苦荬菜药材的HPLC 指纹图谱研究

李慧峰 ，孟 霜，曾桐春 ，李国艳 ，裴妙荣

（1.山西中医药大学，山西晋中030619； 2.山西中西医结合医院，山西太原030013）

中华苦荬菜又名山苦荬、苦菜、小苦苣菜等，为菊科苦荬菜属（Ixeris）植物小苦苣菜［Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai］的干燥全草。性寒味苦，分布广泛，资源丰富，在我国大部分地区均有分布。中华苦荬菜具有清热解毒、凉血消肿、活血破瘀、排脓收敛的功效。经研究发现其具有显著的降血糖作用［1-5］。目前对中华苦荬菜药材指纹图谱研究未见文献报道，故本研究采用高效液相色谱法建立中华苦荬菜的指纹图谱分析方法，为有效控制中华苦荬菜药材质量提供科学方法。

1 实验材料

Waters 2695 高效液相色谱仪（美国沃特斯公司），Waters 2998 PAD 检测器，Waters Empower 色谱工作站；HANGING FA2104 电子分析天平（上海精科天平仪器厂，精密度为万分之一）；梅特勒AB135-S 电子分析天平（上海志荣电子科技有限公司，精密度为十万分之一）；KQ3200E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

10 批中华苦荬菜药材均采于山西太原、左权等地，经山西中医药大学中药学院鉴定教研室裴香萍老师鉴定，鉴定结果：本品为菊科植物中华苦荬菜［Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai］的干燥全草；木犀草苷对照品（批号：111720-201609，购于中国药品生物制品检定所）；甲醇为色谱纯，乙醇、冰乙酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil （钻石）C18色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相 A 为甲醇，B 为 0.5%冰醋酸水溶液，梯度洗脱条件见表1；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长 350 nm。

2.2 对照品溶液制备

取木犀草苷对照品适量，用十万分之一分析天平精密称定，加入甲醇制成1 mL 含54.3 μg 的溶液，摇匀，0.45 μm 滤膜滤过，即得。

表1 梯度洗脱条件

2.3 供试品溶液制备

取干燥的中华苦荬菜药材粉末（过3 号筛）约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入体积分数为70%的乙醇50 mL，称定质量，水浴加热回流提取1 h，放冷，再次称定质量，用70%的乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察 精密吸取同一份中华苦荬菜药材供试品溶液10 μL，连续进样6 次，记录指纹色谱图。以11 号峰木犀草苷为参照峰，计算并比较各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性。结果表明，1～18 号共有指纹峰相对保留时间和相对峰面积积分值的RSD 为0.89%～2.97%，符合中药指纹图谱技术要求（RSD＜3%）。同时采用中药色谱相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度，均大于0.99，表明实验仪器稳定，精密度良好。

2.4.2 重复性考察 取同一批次中华苦荬菜平行6 份，分别按照2.3 项下方法制备供试品溶液，进样，记录指纹图谱。以11 号峰木犀草苷为参照峰，计算并比较各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果表明1～18 号共有指纹峰相对保留时间及相对峰面积积分值的RSD 为0.02%～2.96%，符合中药指纹图谱技术要求（RSD＜3%）。同时采用中药色谱相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度，均大于0.99，表明该方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性考察 精密吸取同一份供试品溶液10 μL，分别于 0 h、2.5 h、5 h、7.5 h、10 h、15 h 进样，记录指纹色谱图。以11 号峰木犀草苷为参照峰，计算并比较各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果表明1～18 号共有指纹峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 为0.01%～2.97%，符合指纹图谱技术要求（RSD＜3%）。同时采用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在15 h 内稳定。

2.5 指纹图谱的建立

取10 批中华苦荬菜药材样品，分别精密称取1 g，按照上述2.3 项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，得到10 批中华苦荬菜样品的HPLC 指纹图谱，结果见图1。通过确认11 号峰为木犀草苷，其峰面积较大且较稳定，保留时间适中，故选择此峰作为参照峰。将10 批药材指纹图谱导入采用药典委员会推荐的指纹图谱相似度评价软件，进行色谱峰匹配，匹配结果见图2，所得对照指纹图谱见图3。以2 号峰木犀草苷为参照峰，确定18 个共有峰为构成中华苦荬菜药材的指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间及相对峰面积见表2、3。10 批供试品与对照指纹图谱相似度计算结果分别为 0.943、0.994、0.952、0.958、0.996、0.919、0.998、0.939、0.976、0.980。

图1 木犀草苷和样品色谱图

图2 10 批中华苦荬菜药材指纹色谱图

图3 对照指纹图谱

3 讨 论

本研究对提取方法、检测波长、流动相系统进行了系统考察。采用二极管阵列检测器对图谱进行了全波长扫描，结果表明在350 nm 下的色谱基线平滑，谱图特征性强，色谱信息较为丰富，故选用350 nm 作为测定波长。流动相条件选择中分别考察了甲醇-0.2%磷酸水溶液和甲醇-0.5%冰醋酸水溶液两种溶剂系统梯度洗脱，结果表明甲醇-0.5%冰醋酸水溶液系统的色谱峰分离效果好，色谱峰峰形对称性较好，保留时间适中，更能全面反映样品所含化学成分信息，故选甲醇-0.5%冰醋酸水溶液作为流动相。

表2 10 批中华苦荬菜药材共有指纹峰的相对保留时间

表3 10 批中华苦荬菜药材共有指纹峰的相对峰面积

本研究以木犀草苷为参照峰确定了中华苦荬菜的18 个共有峰，并通过相似度计算软件得出10 批样品相关性较好，色谱图化学指纹信息完整，色谱峰分离度好，特征明显，为中华苦荬菜药材质量控制提供了科学依据。但由于中华苦荬菜药材因产地及采收时间不同，所含成分的含量差异较大，且木犀草苷含量较高，致使其他成分的峰高相对较低，造成指纹图谱中含量较少成分特征丢失，故有待进一步研究。