复方当归注射液对叔丁基过氧化氢诱导的EA.hy926 细胞氧化损伤的保护作用

冀宇兰 ，郭博文 ，苗俊秋 ，原红霞 ，李青山

（1.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西晋中030619；2.山西中医药大学，基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室，山西晋中030619）

●“实验”虽然是现代科学研究常用的方法，然在我国却自古有之。古代学者王冲说“等类众多，行事比肩，略举较著，以定实验也”，颜之推说“昔在江南，不信有千 人帐，及来河北，不信有二万斛船，皆实验也”，大凡此义均与现代科学意义上的experiment相通。照此，传统中医药学并非只是经验之学，而更充满实验的思想和方法。实验中医药学，将现代实验科学的方法和传统中医药学的实验方法融合起来，开拓现代实验生物学、医学和药物科学的新领域。

心血管疾病是导致人类死亡的主要原因之一，其发病率和致死率呈逐年上升趋势［1-3］。研究发现，氧化应激诱导血管内皮细胞损伤是诱发心血管疾病如心力衰竭、缺血再灌注损伤等的重要因素［4］。

复方当归注射液是由当归、川芎和红花制成的常用中药复方制剂，其功效为活血通经、祛瘀止痛［5］，临床上常用于心脑血管缺血性疾病的治疗［6］。现代药理学实验表明，复方当归注射液具有改善大鼠脑缺血、心肌缺血等作用［7］，目前针对复方当归注射液的临床研究和药理研究报道较多，但其作用机制报道较少。因此，本研究从抗氧化应激的角度，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）清除法及羟基自由基清除法测定复方当归注射液的抗氧化活性，在此基础上以对叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）氧化应激损伤建立体外模型，进一步研究复方当归注射液在细胞水平的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂 EA.hy926 人脐静脉细胞融合细胞购自中科院上海细胞库；复方当归注射液购自上海新亚药业高邮有限公司，批号：180605-2）。高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液均购自武汉博士德生物工程有限公司，乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原性谷胱甘肽（GSH-Px）试剂盒均购自碧云天生物技术研究所，噻唑蓝、二甲基亚砜（DMSO）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 实验仪器 生物安全柜（ESCO，型号AC2-4S1）；二氧化碳恒温培养箱（ESCO，型号CCL-170B-8）；倒置光学显微镜（麦克奥迪）；连续波长多功能化学发光荧光酶标仪（Molecular devices）；台式高速冷冻离心机（Genespeed）；-80 ℃超低温冰箱（ESCO，型号 UUS-714A-1-5D-SS）；微量加样器（Eppendorf）；96 孔板混匀仪（WIGGENS）。

1.2 实验方法

1.2.1 复方当归注射液DPPH 自由基清除率测定 参照 Siow HL 等［8］方法测定 DPPH 自由基清除率。具体步骤如下：取2 mL DPPH 溶液（浓度约为0.05 mg/mL），与不同浓度复方当归注射液2 mL，充分混匀，暗处反应30 min，517 nm 处测量其吸光度值Asample，控制样本用2 mL 蒸馏水代替提取物，进行相同的处理后，于517 nm 处测定吸光度，结果记为Acontrol。BHT 为阳性对照。按公式（Acontrol-Asample）/Acontrol×100%，计算复方当归注射液的DPPH 自由基清除率（%）。

1.2.2 复方当归注射液羟基自由基清除率测定 参照惠和平等［9］方法稍做修改测定羟基自由基清除率。具体步骤如下：在反应体系中分别加入0.2 mL 7.5 mmol/L 邻二氮菲、2 mL PBS 溶液（0.15 mol/L，pH 7.5）、0.2 mL 7.5 mmol/L 硫酸亚铁溶液和 3.8 mL蒸馏水，加入待测样品0.4 mL 混匀后，加入0.4 mL体积分数1 %双氧水溶液摇匀，37 ℃条件下水浴60 min，在 510 nm 处测其吸光度（A 样）；另设阴性对照管和正常管，阴性对照管不加待测样品（用0.4 mL 蒸馏水代替样品液），重复上述操作，在510 nm 处测其吸光度（A 损）；正常管不加待测样品和双氧水溶液（用0.8 mL 蒸馏水代替），重复上述操作，在510 nm 处测其吸光度（A 空）。按公式（A 样-A 损）/（A 空-A 损）×100%，计算复方当归注射液羟基自由基清除率（%）。

1.2.3 复方当归注射液对EA.hy926 细胞氧化损伤保护作用

1.2.3.1 EA.hy926 细胞培养 EA.hy926 细胞常规培养于含10 %（V/V）胎牛血清和1 %青链霉素混合液的高糖DMEM 培养基中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，待细胞达到80%左右的融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化并传代，取生长状态良好处于对数生长期的细胞用于实验。

1.2.3.2 MTT 法检测细胞活性 取对数生长期的EA.hy926 细胞，以每毫升 1.0×105个接种于 96 孔板，每孔100 μL。将培养板放入孵箱中，37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下正常培养，待细胞贴壁后，以不同浓度（5，10，20 μL/mL）的复方当归注射液分别孵育6 h，12 h 和24 h，弃去培养液，再以600 μmol/L 的t-BHP 继续处理3 h。以含1%双抗的DMEM 培养基为正常组，每组各5 个平行。每孔加入 MTT（5 mg/mL）10 μL，继续培养 4 h，小心吸取上清液，每孔加入100 μL 的DMSO 溶解结晶颗粒，波长490 nm 处测定光密度值。

1.2.3.3 LDH 活力、MDA 含量及 GSH-Px、SOD 活性检测 EA.hy926 细胞经不同浓度（5，10，20 μL/mL）复方当归注射液预处理，弃去培养液，再以600 μmol/L t-BHP 作用 3 h 后，0.25 %胰酶消化，冷PBS 清洗两次，然后采用细胞裂解缓冲液进行细胞裂解，10 000 r/min、4 ℃离心 10 min，取上清，分别按 LDH、MDA、GSH-Px 和 SOD 试剂盒说明书进行检测。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 复方当归注射液清除DPPH 自由基的能力

不同浓度的复方当归注射液DPPH 自由基清除活性如图1A 所示，结果表明复方当归注射液对DPPH 自由基具有清除作用，且具有量效关系。应用GraphPad Prism 7.04 软件处理复方当归注射液的量-效关系数据并计算其清除DPPH 自由基的 EC50值为 20.88 μL/mL。

2.2 复方当归注射液清除羟基自由基的能力

不同浓度的复方当归注射液羟基自由基清除活性如图1B 所示，结果表明复方当归注射液对羟基自由基的清除活性随浓度升高而增大，呈现浓度依赖性。应用GraphPad Prism 7.04 软件处理复方当归注射液的量-效关系数据并计算其清除羟基自由基的EC50值为0.8211 mL/mL。

图1 复方当归注射液对DPPH 自由基、羟基自由基清除率的影响

图2 复方当归注射液对t-BHP 诱导的EA.hy926 细胞存活率影响

2.3 复方当归注射液对EA.hy926 细胞氧化损伤保护作用

2.3.1 复方当归注射液对t-BHP 损伤的EA.hy926 细胞活性的影响 与正常细胞组相比，6 h，12 h 和24 h 3 个时间段模型组（t-BHP 损伤组）细胞活力显著降低（P＜0.01）；与模型组（t-BHP 损伤组）相比，复方当归注射液组细胞活力随浓度梯度增高逐渐上升（P＜0.05，P＜0.01），呈现了明确的量效关系。结果见图2。

2.3.2 复方当归注射液对细胞培养液中SOD、GSH-Px 的活力及MDA、LDH 含量的影响 与正常细胞组相比，模型组（t-BHP 损伤组）SOD、GSH-Px活力明显下降（P＜0.01），MDA、LDH 含量明显上升（P＜0.01）；与模型组（t-BHP 损伤组）相比，复方当归注射液组SOD、GSH-Px 活力显著升高（P＜0.01），MDA、LDH 含量显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。结果见图3。

图3 复方当归注射液对t-BHP 诱导的EA.hy926 细胞SOD、GSH-Px 的活力及 MDA、LDH 含量的影响

3 讨 论

近年来大量研究表明生物体内过量的氧自由基及氧化应激是导致心血管系统心力衰竭、缺血再灌注损伤的重要原因之一［10］。复方当归注射液作为当归、川芎、红花为组分制成的中药复方注射液，临床上常用于心脑血管缺血性疾病的防治［6］，为阐明临床上复方当归注射液的作用机制，本研究以DPPH 自由基及羟基自由基清除法并进一步在细胞水平建立氧化应激损伤模型来系统研究复方当归注射液的体外抗氧化性能。

DPPH 自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其可以捕获其他的自由基［11］，对 DPPH 自由基的清除效果可以反映物质的抗氧化能力。OH自由基能与绝大部分生物大分子物质发生反应，其反应可能导致严重的组织损伤或细胞死亡［12］。因此，及时清除多余的OH 自由基对保护机体的正常生命活动和生理代谢反应具有重要作用。本研究结果显示，复方当归注射液能有效地清除DPPH 自由基和羟基自由基，具有一定的体外抗氧化活性。

自由基激发的脂质过氧化物可以导致质膜损伤，当细胞破坏或细胞膜通透性增加时，LDH 从细胞内漏出，因此，LDH 水平可较准确反映细胞或细胞膜损伤的程度［13］。MDA 是脂质过氧化产物之一，其水平的高低可反映机体脂质过氧化的程度，细胞内MDA 含量可提示氧化应激损伤程度［14］。本研究中，模型组LDH 和MDA 升高，而不同浓度的给药组LDH 和MDA 含量随复方当归注射液剂量的增加逐渐下降，表明复方当归注射液可以维持EA.hy926 细胞的完整性。SOD 是一种重要的抗氧化酶，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，其活性高低间接反映机体清除氧自由基的能力［15］。GSH-Px 作为抗氧化酶能够拮抗氧化应激引起的细胞损伤，修复受损细胞，其活性可以反映机体的抗氧化能力。本研究中，模型组SOD 和GSH-Px 下降，而不同浓度给药组中SOD 和GSHPx 随复方当归注射液剂量的增加则逐渐升高，表明复方当归注射液具有潜在的抗氧化作用。

综上所述，本研究结果表明复方当归注射液对DPPH 自由基和OH 自由基均有较明显的清除作用，对t-BHP 诱导EA.hy926 细胞氧化损伤有一定的保护作用，提示复方当归注射液的药理作用机制可能与其抗氧化作用密切相关。