绿盲蝽卵黄原蛋白(Vg)基因片段克隆及不同生境表达量分析

张未仲，胡增丽，刘朝红，韩 凤，赵龙龙

（山西省农业科学院果树研究所，太原 030001）

0 引言

绿盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Dür)隶属半翅目(Hemiptera)，盲蝽科(Miridae)，别名花叶虫、小臭虫等。该虫主要以若虫和成虫刺吸植物幼芽、幼叶、花、果、枝中的汁液[1]，造成花、叶缺刻或果实表面刺吸处木栓化。果面木栓组织周围凹凸不平，形成畸形果，严重影响果实的食用价值和商品价值[2]。绿盲蝽为多寄主性害虫，寄主范围广。近年来，随着产业结构的逐渐调整，果树种植面积大幅度增加，为绿盲蝽提供了丰富的寄主和适宜的越冬场所[3]。绿盲蝽逐渐从棉花向各种果树转移，在枣园、葡萄园尤其严重[4-6]。

绿盲蝽寄主众多，行为活泼，防治困难。目前对绿盲蝽防治方法的研究已经从宏观的毒力药效过渡到生理生化、分子机制等方面[7-9]。绿盲蝽寄主植物多样，研究绿盲蝽在不同生境的寄主适应性，可以明确绿盲蝽发生规律，适应特性，对于预测虫口数量，提高防治效率均有实际的意义。

为了判断绿盲蝽的适合生境，较为准确的预测绿盲蝽的发生区域及发生时间。调查虫口基数是常用的方法。昆虫的虫口基数取决于产卵量，产卵量取决于繁殖力。卵黄原蛋白是体现昆虫繁殖力的关键因子。

卵黄蛋白(vitellin，Vn)是一种高密度糖脂蛋白，占卵黄成分的60%～90%。卵黄蛋白可以为动物胚胎和幼体的早期发育提供主要的营养物质[10]。卵黄原蛋白(vitellogenin，Vg)是卵黄蛋白的前体，是一种受雌激素调控的重要的生殖蛋白[11]。在大多数昆虫中，卵黄原蛋白在脂肪体中合成，被发育中的卵母细胞所摄取，为正在发育的胚胎提供氨基酸、碳水化合物、维生素、脂肪等营养和功能性物质，是胚胎发育的重要物质基础[12]。卵黄原蛋白作为存储蛋白，不仅可以提供营养物质，影响昆虫产卵的数量和质量，还有参与免疫防御、寿命调控等多种生物学功能和复杂的新陈代谢过程[13-14]，同时卵黄原蛋白也广泛应用于检测环境激素及内分泌干扰物的生物指标[15-17]。目前，对昆虫卵黄原蛋白研究主要涉及鳞翅目、双翅目、膜翅目和半翅目等，己有7个目50多种昆虫的Vg基因序列被克隆[18]。

现有研究表明，卵黄原蛋白为卵母细胞生长发育提供所需的营养物质，在卵生雌性动物胚胎发育中起关键性作用[19]。不仅为胚胎发育提供营养，而且作为分子进化研究的对象而备受人们关注[20]。目前对于卵黄原蛋白的研究主要集中在晶体结构、系统进化、功能效应[21]、合成与激素调节及其机理方面[22-23]，寄主环境、取食植物对昆虫卵黄原蛋白影响研究较少。通过对不同生境绿盲蝽卵黄原蛋白的研究可以推测绿盲蝽在不同生境中的繁殖力，明确其在不同生境的适合度。针对绿盲蝽发生严重的生境，利用卵黄原蛋白设计靶标药剂，可以降低虫口基数，减少化学农药的施药次数，缓解害虫的抗药性，是生物防治的发展方向。

本研究希望通过对卵黄原蛋白的研究确定比较合适的产卵生境，从分子角度确定绿盲蝽较为偏好的果树寄主，为绿盲蝽专项防治和精准用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 昆虫采集与虫口调查

山西省农业科学院果树研究所（晋中市太谷县）枣资源圃、葡萄实验站中采集绿盲蝽成虫。调查并记录2个生境中的虫口发生量，Microsoft excel 2007绘制动态曲线。

1.2 实验试剂和方法

利用试剂盒提取绿盲蝽总RNA，反转录合成cDNA第一条链。查询昆虫已知序列设计合成简并引物，扩增目的基因片段。将PCR扩增产物连接、转化、回收测序并进行序列同源性及进化树分析。根据测序结果设计合成荧光定量PCR引物，对不同生境的绿盲蝽基因表达量进行检测。所需实验试剂与步骤参照周旭凌等[21]研究。

1.3 设计并合成兼并引物与荧光定量PCR引物

通过比对已发表的昆虫序列设计引物，根据同源性设计1对简并引物，根据目的基因片段设计合成1对荧光定量PCR引物。引物序列如表1所示。

表1 简并引物与荧光定量PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 不同生境虫口动态

枣园绿盲从5月14日调查到9月29日结束，枣园绿盲蝽有4个发生高峰，分别为，5月下旬、6月下旬与8 月中旬，及9 月下旬。而葡萄园有2 个高峰期，分别为6月中旬与8月上旬。

2.2 总RNA的提取与PCR扩增产物的鉴定

利用试剂盒提取绿盲蝽成虫总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2显示，采用试剂盒将得到的绿盲蝽总RNA反转录从而获得第一链cDNA，并将其作为扩增模板，利用引物Vg-F1，Vg-R1 进行PCR 扩增。扩增的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3显示，在750 bp附近有一条亮带，并且与预期片段大小基本一致，推断可能是Vg基因的中间片段，还需进一步测序鉴定。

2.4 测序结果及序列分析

将重组质粒进行测序，获得一段大小为732 bp 的基因片段，该序列编码244 个氨基酸（图3）。Genbank登录号为ARJ54906.1。将该片段的核昔酸序列与NCBI数据库中已注册的其他昆虫Vg基因的氨基酸序列进行Blast同源性分析比较，结果显示（图4），该绿盲蝽Vg基因片段的氨基酸序列与基因库中登录的赤须盲蝽Trigonotylus caelestialium（登录号为BAJ33507.1）、烟盲蝽Nesidiocoris tenuis（登录号为AGV05363.1）、黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis（登录号为AJI43739.1）的氨基酸序列同源性分别达到86%、82%、80%，与其他昆虫褐飞虱Niaparvata lugens（登录号为AB353856.1）、黄胡蜂Vespula vulgaris（登录号为AER70365.1）、BI-VG熊蜂Bombus ignitus（登录号为ACM46019.1）相比较，序列同源性分别为40%、47%、43%，同AS-VG 天蚕蛾Actias selene（登录号为ADB94560.1）；BM-VG 家蚕Bombyx mandarina（登录号为BAE47146.1）比较，同源性分别为41%、40%。将得到的Vg基因氨基酸序列片段与其他昆虫Vg 基因的氨基酸序列进行进化树分析比较，结果显示（图5），相比较的昆虫按照基本按照半翅目、膜翅目、鳞翅目分成3组，蛾类绿盲蝽同赤须盲蝽先聚合在一起。其次为烟盲蝽、黑肩绿盲蝽、褐飞虱；熊峰、黄胡蜂集合在一起且同菜叶蜂邻近；家蚕同天蚕蛾聚合在一起。根据同源性分析结果，该序列与其他蝽类昆虫的Vg基因氨基酸序列的同源性均在80%以上，以及进化树分析推测本研究获得的基因片段为绿盲蝽Vg 基因片段，将该基因命名为AL-VG基因。

卵黄蛋白序列来源及GenBank 登录号如下：TCVG:赤须盲蝽Trigonotylus caelestialium(BAJ33507.1)；CL-VG:黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis(AJI43739.1)；NT-VG:烟盲蝽Nesidiocoris tenuis(AGV05363.1)；NL-VG:褐飞虱Niaparvata lugens(AB353856.1)：VV-VG:黄胡蜂Vespula vulgaris(AER70365.1)；AR-VG:菜叶蜂Athalia rosae(AB007850.1)；BI-VG:熊蜂Bombus ignitus(ACM46019.1)；AS-VG:天蚕蛾Actias selene(ADB94560.1)；BM-VG:家蚕Bombyx mandarina(BAE47146.1)。

2.5 不同生境表达量检测

如图6所示，绿盲蝽Vg基因在枣园和葡萄园中表达量，经荧光定量检测可知，枣园中绿盲蝽Vg基因相对表达量低于葡萄园。

3 讨论与结论

本研究通过比较已发表昆虫Vg基因，设计简并引物并以绿盲蝽第一链cDNA 为模板进行PCR 扩增，得到长度为732 bp 的基因片段。通过序列检索比对表明，绿盲蝽Vg基因片段的氨基酸序列与基因库中登录的赤须盲蝽、黑肩绿盲蝽、氨基酸序列同源性达80%以上，系统进化分析进一步表明，绿盲蝽Vg基因与赤须盲蝽、黑肩绿盲蝽的亲缘关系最近，与传统分类学绿盲蝽结果符合。

有些研究表明一些节肢动物体中Vg 基因在逆境中表达量会升高。如蜜蜂种群为了适应寒冷的气候，蜜蜂体内血淋巴中的Vg 含量会升高[25]，泥蚶(Tegillarca granosaLinnaeus)卵黄蛋白原基因(Vg)在重金属Pb 胁迫下含量会升高[26]，因此，卵黄原蛋白含量提高有时可视为对外界环境胁迫下的响应。相同的大气条件下，不同的寄主植物是影响昆虫虫口数量、发育进度、产卵量的主要环境因子。不同的寄主品质会对昆虫的Vg造成影响，从而影响生殖力和产卵量。

本实验通过2 个生境的虫口数量统计分析，发现在整个生长期内枣园绿盲蝽发生量大部分时间高于葡萄园。克隆了绿盲蝽卵黄原蛋白(Vg)基因片段，检测并比较其在葡萄园与枣园2个不同生境中的基因表达量，结果表明葡萄园绿盲蝽的Vg 基因表达量高于枣园。结合前人的研究，推测枣园的生境比葡萄园更适合绿盲蝽生存。

然而也有研究表明斜纹夜蛾(Spodoptera lituraFabricius)取食喜食的甘蓝后，虫体体内Vg 表达量高于取食不喜食的空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)的虫体表达量[27]。即表达量高是适应寄主的一种表现。与本实验的结论不符，造成差异的原因有待室内实验的进一步探索。

另外有研究表明长红锥蝽(Rhodnius prolixus)其雄虫也含有Vg[28]。本研究也发现有类似的现象。卵黄原蛋白作为卵黄蛋白前体不仅是在绿盲蝽雌虫体内，在雄虫体内也有表达。

本研究通过克隆绿盲蝽Vg基因cDNA片段，期望能为绿盲蝽相关基因表达提供参照。希望从分子角度分析绿盲蝽对不同寄主的适应性，为快速检测适合度，筛选合适间作昆虫提供理论依据。随着昆虫抗药性的增强，筛选低毒生物农药成为农药发展的趋势。卵黄原蛋白也可为生物制剂的研发提供理论靶标。本研究仅检测了绿盲蝽在不同生境的最后一个世代的卵黄原蛋白基因表达量，对于其他世代的表达差异及不同果树叶片喂养后，虫体的生殖力的差异还有待进一步研究。