EPS对肺动脉高压大鼠右心室重构的影响及机制

李瑞敏，丁艳艳，张永祥

(首都医科大学大兴教学医院呼吸与危重症医学科，北京 大兴 102600)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种致死率极高的慢性肺循环疾病，病理生理机制为肺循环阻力的增加，引起右心室后负荷增加，导致右心室重构，严重时诱发右心衰竭，甚至造成死亡[1]。因此寻求疗效确切且能有效改善肺血管及右心室重构的药物具有重要意义[2]。

研究表明[3]，野百合碱(monocrotaline,MCT)可以诱导PAH大鼠右室心肌氧含量降低、心肌细胞线粒体氧耗上调。依帕司他(epalrestat，EPS)是典型的醛糖还原酶选择性抑制剂，研究发现EPS具有降压、抑制血管平滑肌细胞增殖和血管重构等作用[4-5]，本文拟研究EPS对MCT诱导的肺动脉高压大鼠右心室重构的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取SD大鼠80只，体质量180～200 g，10周龄，购自苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司，许可证号：SDK(苏)2009-0001；所有大鼠饲养于标准鼠笼，每笼5只，室温22～25 ℃，湿度35%～50%，自由摄食及饮水，适应性喂养1周后进行试验，随机分为对照组、模型组、50 mg/kg EPS，100 mg/kg EPS组，每组20只。

1.2 实验方法

1.2.1 肺动脉高压大鼠模型建立 按照经典方法给予SD大鼠60mg/kg皮下注射野百合碱构建PAH大鼠模型，对照组皮下注射等量的生理盐水。造模过程中的28天内，模型组共自发性死亡大鼠7只，死亡率为35%。

1.2.2 药物干预 首先用蒸馏水将磨成粉末状的EPS稀释成混悬液，自注射MCT之日起，分别给予50 mg/kg EPS，100 mg/kg EPS，模型组给予等量的生理盐水。一直持续28天，并全程密切观察大鼠的一般情况和生存状态并记录。

1.2.3 血流动力学指标测定 首先用60 mg/kg的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠，将直径为0.5 mm的聚乙烯PE导管连接上压力换能器并经右颈外静脉插入右心室及肺动脉，MedLab-TA6008多导生理记录仪(南京美易科技有限公司生产)分别记录右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)和肺动脉收缩压(PASP)[6]。

1.2.4 组织标本处理及测定

上一步结束后，打开胸腔暴露心和肺，在右心室剪一小口，并剪开左房，将连于灌注装置的磨平的针头经右心室插入至肺动脉，开启灌注装置，用生理盐水冲洗肺至干净，取出心脏，去掉大血管和心房，分离左、右心室，滤纸吸干表面水分，称RV重及LV+SEP重，并计算右心室肥厚指数(RVHI)，右心室质量指数(RVMI)[7]。将右心室心尖处组织置于4%多聚甲醛固定2天，用于制备石蜡切片;准确称取100 mg右心室组织置于液氮中研磨并加入1 mL Trizol试剂进行裂解，置于-80℃冰箱保存；剩余右心室置于液氮中研磨，并在冰上用裂解液对组织裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min后提取蛋白，检测相关蛋白表达水平。

1.2.5 HE观察

用4%多聚甲醛固定大鼠右心室心尖部48 h，石蜡包埋切片，进行HE染色，具体操作步骤如下：将石蜡切片置于烘箱中60 ℃烤1～2 h；石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水，苏木素染10 min，流水冲洗，去余色，7%盐酸乙醇分化数秒钟，流水冲洗，切片变蓝约15 min，95%乙醇30 s，酒精性伊红染30 s，95%乙醇30 s两次，100%乙醇30 s两次，石碳酸二甲苯30 s，二甲苯30 s两次，中性树胶封片[8]。

1.2.6 免疫组化染色

免疫组化染色采用链霉素蛋白-生物素免疫染色法。首先常规石蜡切片脱蜡水化，PBS洗涤3 min，滴加0.3%H2O2，并于37 ℃孵育20 min，再用PBS洗涤3 min后用正常血清封闭20 min，接着一抗孵育过夜(4 ℃)，用PBS洗涤3 min，用二抗室温37 ℃孵育0.5 h，用PBS洗涤，滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，并室温孵育0.5 h，PBS洗涤3 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明。中性树胶封片。染色过程中用PBS缓冲液取代一抗作为空白对照[9]。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.2 大鼠血流动力学指标

与对照组相比，RVSP、mPAP和PASP在模型组显著增高，给予EPS后RVSP、mPAP和PASP显著降低，并呈剂量依赖效应。见表1。

表1 各组大鼠血流动力学指标比较

2.3 大鼠右心室重构指标

与对照组比较，模型组RVHI和RVMI显著增加，给予EPS干预后，RVHI和RVMI显著降低，并呈剂量依赖效应。见表2。

2.4 大鼠右心室心肌HE染色

对照组右心室心肌纤维排列整齐，胞浆染色均匀，胞核位于中央，呈卵圆形，核膜边界清楚；模型组心肌纤维排列紊乱，横纹消失，心肌细胞肥大，部分胞核宽大畸形；EPS组心肌形态学改变较模型组有所改善，其中高剂量组好于低剂量组。见图1。

表2 各组大鼠右心室重构指标比较

图1 右心室心肌HE染色观察(200×)A：对照组；B：模型组；C：50 mg/kg EPS组；D：100 mg/kg组

2.5 各组右心室心肌Cx43表达

与对照组比较，模型组Cx43光密度显著降低，给予EPS干预后，Cx43光密度显著增高，并呈剂量依赖效应。说明PAH大鼠右心室心肌Cx43表达降低，EPS逆转右心室重构与增加Cx43表达有关。见表3和图2。

表3 各组大鼠右心室心肌Cx43比较

图2 Cx43免疫组化染色(200×)A：对照组；B：模型组；C：50 mg/kg EPS组；D：100 mg/kg组

3 讨 论

MCT是从野百合中提取的一种双稠吡咯类生物碱，本身是无活性的，在大鼠肝脏内经P450氧化酶可转化为有活性的脱氢产物野百合碱吡咯，可以选择性作用于肺血管床[10]。MCT可选择性地损伤肺血管内皮细胞，引起肺小动脉平滑肌细胞进行性增殖、肺动脉血管内栓塞形成、诱导肺小动脉肌化和重构、降低内膜完整的肺血管数量、升高肺阻力，最终导致肺动脉高压[11]。皮下注射MCT是公认的用于研究肺动脉高压、非原发于心脏的右心室重构和右心衰竭的方法[12]，本实验结果也证明，采用MCT能成功构建肺动脉高压和右心室重构的动物模型。醛糖还原酶(AR)是多元醇通路的关键酶，具有NADPH依赖性。AR被激活后可以使NADPH/NADP+比值下降，从而降低抗氧化能力，进而增强氧化应激反应。有研究发现，AR/NADPH氧化酶-4(NOX-4)介导的氧化应激在肺动脉高压右心室重构中发挥了重要的作用[13]。EPS为AR抑制剂，可通过抑制AR表达，抑制NOX-4介导的氧化应激反应，从而改善肺动脉高压大鼠右心室重构。本实验结果发现，在实验造模的28天内，模型组共自发性死亡大鼠7只，死亡率为35%，对照组、EPS组无大鼠死亡，说明EPS可以降低MCT诱导的肺动脉高压大鼠的死亡率，也间接地说明EPS可以减轻肺动脉高压对大鼠的病死率。从血流动力学指标(RVSP、mPAP和PASP)可以看出，由高到低的是模型组、EPS组、对照组，说明示EPS具有降低PAH大鼠肺动脉压力的作用。从右心室重构指标可以看出，与对照组相比，模型组RVHI和RVMI明显升高，说明MCT成功制造肺动脉高压模型和右心室重构模型，给予EPS干预后，PAH大鼠右心室重构得到抑制。通过对大鼠的右心室心肌进行HE染色，结果说明肺动脉高压大鼠的右心室心肌紊乱，EPS在抑制肺动脉高压同时，也能改善心肌结构。Cx43是哺乳类动物心室工作细胞最重要的缝隙连接蛋白，它的正常表达和分布是心肌细胞正常活动及协调舒缩的重要保证[14]。当压力负荷持续存在时(例如肺动脉高压)，Cx43的密度会比正常减少40%，本实验结果显示，模型组Cx43的表达显著降低、注射EPS后Cx43的表达显著增加。结合前面结果，我们推测EPS可能是通过上调了Cx43表达量逆转肺动脉高压大鼠右心室重构[15]。

综上所述，EPS可以减轻MCT诱导的PAH大鼠右心室重构，其机制可能与增加右心室心肌Cx43表达，抑制醛糖还原酶作用有关。