食盐添加量对养殖大黄鱼鱼糜凝胶特性的影响

廖慧琦，吕春霞，陆益钡，胡远辉，雷叶斯，张慧恩，杨华

(浙江万里学院，浙江 宁波，315100)

大黄鱼又名黄花鱼，其味道鲜美，营养丰富，深受国内外消费者的青睐[1]。大黄鱼蛋白质丰富，是理想的动物蛋白来源，同时含有许多微量元素，能够清除人体代谢产生的自由基，有延缓机体衰老，提高免疫力等多种功效[2-4]。但是因为野生大黄鱼产量低且价格昂贵，故上世纪80年代中后期开始研究大黄鱼的人工养殖，养殖大黄鱼的产量迅速上升[5-6]。随着产量的增加，如何深度发掘利用资源，提高经济利用价值成为亟待解决的问题。目前养殖大黄鱼仍以初级加工制品等为主，精加工及高附加值产品仍然较少[7]。因此，需要一种更好的加工方式来提高养殖大黄鱼产品的附加值，这对养殖大黄鱼产业发展具有重大意义。

鱼糜制品因具有高蛋白、低脂肪等特点深受消费者的喜爱，在鱼肉制品中占有很大比例[8]。据了解目前市场上的鱼糜制品几乎都是由低值鱼加工而成，不过随着人们对食品的营养需求提高，某些高档鱼类也用于加工鱼糜制品，例如带鱼鱼糜制品[9]。大黄鱼肉质鲜美、营养丰富，研究开发大黄鱼鱼糜制品可以提升大黄鱼价值，丰富鱼糜制品的种类，扩大市场。鱼糜的凝胶特性是评价鱼糜品质的重要指标，所以有效改善鱼糜凝胶特性是目前鱼糜加工的一个焦点问题。

肌原纤维蛋白是形成凝胶最重要的蛋白质，属于盐溶性蛋白质，主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白等。肌原纤维蛋白与肉制品的黏附性、保水性、弹性、质地等密切相关，很大程度上能影响鱼糜凝胶特性[10]。在蛋白质凝胶化过程中都会先加食盐斩拌，其目的是使肌原纤维蛋白充分溶解，进而螺旋结构展开，氨基酸残基充分暴露，呈溶胶状态。研究发现在肌原纤维蛋白中添加NaCl可引起膨胀断裂，使蛋白的持水性增强，黏度增大[11]。刘茹等[12]研究发现，添加2.15%～3%的NaCl后，肉糜的凝胶特性较好，且随着NaCl添加量的增加，肉糜的凝胶特性有所提高。根据研究分析可以看出添加NaCl不仅可以改善鱼糜的风味，还可以促进鱼糜凝胶特性。故研究不同NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响对后期改善鱼糜凝胶品质及生产高质量鱼糜制品具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

养殖大黄鱼，体质量为(0.5±0.1) kg，冰盒保鲜运回实验室，购于宁波路林市场；NaCl、无水乙醇、叔丁醇、Na2HPO4、NaH2PO4均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Bradford法蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio有限公司；戊二醛(分析纯)，麦克林试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TA-XT Plus 物性分析仪，美国FTC公司；XW-80A 漩涡混匀器，西宝生物科技有限公司；ALPHA2-4冷冻干燥仪，上海继谱电子科技有限公司；FC 型酶标仪，上海维城仪器有限公司；In Via-Reflex 拉曼光谱仪，法国Renishaw公司；S-4800 场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；色差计，上海源琦检测仪器有限公司；恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

养殖大黄鱼去头、去尾、去鳞、去内脏等，淋洗干净，沥干取肉，-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取

参照CHIN等[13]和JIANG等[14]的方法稍作修改，取适量鱼糜，加入4倍体积冰提取液(20 mmol/L，pH 7.5磷酸盐缓冲液)，高速匀浆机均浆60 s(7 500 r/min)，将所得的匀浆液冷冻离心10 min(7 000 r/min，4 ℃)，除去上清液，重复3次，得到粗肌原纤维蛋白。再加入4倍体积冰洗液(0.1 mol/L NaCl)，均浆60 s(7 500 r/min)，离心10 min，取沉淀，重复1次上述实验，最后一次匀浆液用3层纱布过滤，以7 000 r/min冷冻离心10 min，得到的沉淀即为养殖大黄鱼肌原纤维蛋白，-40 ℃冷冻48 h，冷冻干燥24 h，液氮研磨成粉，真空包装，干燥保存。

1.3.3 肌原纤维蛋白浓度测定

先将Bradford工作液配制完成，然后取96孔板，将BSA标准品按不同体积依次加到孔中，补充稀释液到20 μL；再在孔中加入一定体积的经磷酸盐缓冲溶液稀释的肌原纤维蛋白样品，补充稀释液到20 μL；然后在各个孔中加入200 μL Bradford工作液，37 ℃恒温摇床放置15～30 min后测OD593。

1.3.4 肌原纤维蛋白凝胶制备

取离心管，加入5 g养殖大黄鱼肌原纤维蛋白，分别添加0%、1%、2%、3%、4%(质量分数)的NaCl，旋涡振荡仪均质5 min，置于水浴锅中，使温度从20 ℃升到70 ℃，加热30 min后立即取出，置于4 ℃冰箱冷藏过夜，在对肌原纤维蛋白凝胶进行测定前要先将样品在室温下放置1 h[15]。

1.3.5 质构指标的测定

肌原纤维蛋白凝胶在90 ℃下加热20 min，冰水冷却至室温后置于质构仪载物台上，采用P/25探头，应变力为0.1 N，测试速度为60 mm/min，形变量为50%，室温下完成测定。

1.3.6 肌原纤维蛋白凝胶持水性的测定

肌原纤维蛋白凝胶的持水性测定参照颜伟华等[16]的方法并略做修改，取养殖大黄鱼肌原纤维蛋白凝胶于离心管内离心10 min(4 ℃，8 000 r/min)，按照公式(1)计算凝胶持水性(water binding capacity,WHC):

(1)

式中：W1为离心前样品质量；W2为离心后样品质量。

1.3.7 肌原纤维蛋白白度的测定

参照PARRARAVIVAT等[17]的方法并略做修改，将养殖大黄鱼鱼糜凝胶样品切成5 mm左右的薄片，在室温下用色差计测定样品L*、a*、b*值，每组样品平行测定5次，按照公式(2)计算白度值:

(2)

式中：L*值表示样品的亮度；a*值表示样品的红绿值；b*表示样品的黄蓝值。每组实验重复5次，取平均值。

1.3.8 拉曼光谱测定

养殖大黄鱼肌原纤维蛋白凝胶样品采用拉曼光谱分析，参考张自业[15]的方法。将制备好的肌原纤维蛋白凝胶样品置于载玻片上，选择50倍长聚焦镜头对肌原纤维蛋白样品进行聚焦。检测参数为所用功率为100 mW，532 nm氩离子激光器，分辨率为1 cm-1，获取的拉曼光谱范围在400～4 000 cm-1。

1.3.9 凝胶微观结构的观察

参照许艳顺[18]的方法，并略做修改。将养殖大黄鱼鱼糜凝胶切成整齐的块状置于塑料培养皿中，加入一定量的戊二醛，于4 ℃下固定24 h，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3～5次，再用不同含量的乙醇及无水乙醇叔丁醇混合溶液(3∶1、1∶1、1∶3,体积比)、乙醇、叔丁醇漂洗，最后冷冻干燥，喷金，扫描观察。

1.4 数据处理

所有试验均平行3次，数据采用Excel软件作图，IBM SPSS Statistics 25.0进行单样本T检验(n=3)、显著性分析及组间相关性分析，不同小写字母表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶质构特性的影响

质构是判断鱼糜品质的主要感官指标之一，硬度越高，胶黏性越低，弹性、咀嚼性等也会相应地提高[18]。LAURE等[20]发现猪半膜肌蛋白凝胶的破裂力会随盐浓度增大而提高。由表1结果可知，添加了NaCl后的养殖大黄鱼肌原纤维蛋白凝胶的胶黏性、咀嚼性都大于空白组，且在NaCl添加量为2%时达到最大值；凝胶的硬度随NaCl添加量的增加先上升后下降，且组分之间差异显著(P<0.05)；在NaCl添加量为0%～2%时，凝胶的黏附性随NaCl添加量的增加而增大，在添加量为2%时黏附性达到最大值；随着NaCl添加量的增多，内聚性不断增大，NaCl添加量为3%时达到最大(P<0.05)；添加不同量NaCl后养殖大黄鱼肌原纤维蛋白凝胶的弹性显著增大(P<0.05)，NaCl添加量为3%时凝胶弹性达到最大(P<0.05)。这些现象出现的原因可能是由于离子强度的升高，肌原纤维蛋白分子间的静电斥力减弱，分子间距离缩短，蛋白质与蛋白质之间发生聚集，形成更好的凝胶[15]。

表1 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶质构特性的影响Table 1 Effect of different NaCl addition on the texture properties of myofibrillar protein gel

2.2 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶持水性的影响

持水性是肌肉受到外力作用时保持原有水分的能力。肉的持水性不仅影响肉的滋味、香气、多汁性、嫩度、颜色等食用品质，而且还会直接影响肉制品的成品率，故测定肌原纤维蛋白凝胶持水性对鱼糜制品加工具有十分重要的意义。由图2可知，持水性随NaCl添加量的增加而显著上升，在添加量为2%时达到最高，随后开始显著下降(P<0.05)。原因可能是由于在一定浓度的NaCl条件下，蛋白凝胶网络细腻，孔径小，空隙分布较均一，可以容纳更多的水分[21]。研究发现随着离子含量的升高，肌原纤维蛋白的溶解度增大，蛋白变性展开，形成更为致密的三维网状结构，更能吸附包裹水分[15]。

图1 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶持水性的影响Fig.1 Effect of different NaCl addition on water retention of myofibrillar protein gel注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)

2.3 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响

食品的色泽是至关重要的，因为在鱼糜制作过程中的漂洗是不可缺少的，从而除去血渍、腥味物质从而改善凝胶白度，故测定NaCl处理后的肌原纤维蛋白凝胶白度可以为后续加工鱼糜提供参考。不同NaCl添加量的条件下肌原纤维蛋白凝胶白度的变化见表2。由表2可知，随着NaCl添加量的增加，养殖大黄鱼肌原纤维蛋白凝胶的白度值不断升高，NaCl添加量越大，白度值升高的程度越大。

表2 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响Table 2 Effect of different NaCl addition on the whiteness of myofibrillar protein gel

2.4 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶二级结构的影响

拉曼光谱是一种能快速无损检测蛋白质肽链变化的分析技术，通过拉曼光谱分析可以测定蛋白质二级结构的变化及对共价键和非共价键的影响。由图2可知，空白组的峰值最大，NaCl添加量为4%的峰值次之，在NaCl添加量1%～3%时，随着NaCl添加量的增加，峰值降低。拉曼光谱的酰胺Ⅲ带的峰在1 250 cm-1附近，酰胺 Ⅰ 带的峰在1 650 cm-1附近，结合酰胺Ⅲ带、酰胺 Ⅰ 带可以分析出肌原纤维蛋白凝胶二级结构变化。在1 650～1 670 cm-1处，当α-螺旋转变成β-折叠或无规则卷曲时，谱带发生右移[22]。同时拉曼光谱中在515～550 cm-1还可以表示二硫键构象的变化[23-24]。分析发现添加NaCl之后肌原纤维蛋白凝胶的α-螺旋减少，β-折叠或者无规则卷曲增加，β-折叠结构是蛋白质集聚和形成良好凝胶的基础结构，增加鱼糜体系中β-折叠的含量，有助于改善鱼糜制品的质构特性和保水性。

图2 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶拉曼光谱的影响Fig.2 Effect of different NaCl addition on Raman spectroscopy of myofibrillar protein gel

2.5 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响

由图3可以看出，空白组和NaCl添加量组的微观结构具有明显的不同，空白组的凝胶结构断裂严重，网络结构不连续，凝胶空隙的形状不规则。NaCl添加量为1%组的凝胶结构开始趋于连续，孔洞逐渐规则均匀，交联度增高，这可能是因为蛋白之间由于疏水、静电及氢键相互作用的改变，导致其发生聚集和交联，蛋白质开始出现网状结构。在NaCl添加量为2%～4%时，蛋白凝胶结构越来越均匀致密，且孔洞数量明显减少，交联度高，这一现象与其凝胶的质构特性、白度的结果一致。

a-空白组 b-1%NaCl;c-2%NaCl;d-3%NaCl;e-4%NaCl图3 NaCl添加量对肌原纤维蛋白凝胶微观结构的影响Fig.3 Effect of different NaCl addition on the microstructure of myofibrillar protein gel

2.6 鱼糜凝胶与肌原纤维蛋白凝胶的相关性分析

将添加NaCl后的养殖大黄鱼鱼糜凝胶与肌原纤维蛋白凝胶的硬度、黏附性、内聚性、弹性、胶黏性、咀嚼性、持水性的参数进行相关性分析，结果如表3所示。由表3结果可以看出鱼糜凝胶与肌原纤维蛋白凝胶具有一定的相关性，运用皮尔森相关性分析肌原纤维蛋白凝胶与鱼糜凝胶的相关性，发现鱼糜凝胶的硬度、胶黏性与肌原纤维蛋白凝胶的硬度、胶黏性具有很强的相关性；两个体系之间的黏附性、内聚性、弹性、咀嚼性具有中度相关性；而二者之间的白度、持水性具有低度相关性。通过分析发现，NaCl可以通过促进肌原纤维蛋白形成凝胶，从而进一步改善鱼糜凝胶特性。

表3 鱼糜凝胶与肌原纤维蛋白凝胶的皮尔森相关性检验Table 3 Pearson correlation test of surimi gel and myofibrillar protein gel

3 讨论

为了提高鱼糜制品的风味、口感及凝胶特性，在鱼糜制品生产过程中，经常会选择添加一些外源添加剂[25-26]。蒋欣静等[27]研究发现添加大豆胰蛋白酶制剂对鲢鱼肌肉中的肌原纤维蛋白降解有抑制作用。CAMPO-DEAO等[28]将蛋清蛋白加入到用来制作模拟蟹棒的阿拉斯加鳕鱼糜和太平洋牙鳕鱼糜中，发现成品均具有较好的黏弹性，同时提高了鱼糜的蛋白含量。相关资料显示在鱼糜的生产加工中也常会添加一些NaCl，既可以调节鱼糜制品的味道，还可以提高鱼糜制品的凝胶特性[29]。实验结果表明，NaCl对养殖大黄鱼鱼糜肌原纤维蛋白凝胶特性具有显著性影响，添加NaCl后，肌原纤维蛋白凝胶质构特性、凝胶强度、持水性、白度等都有明显增强，同时肌原纤维蛋白凝胶的二级结构也发生明显变化。通过电镜扫描观察，发现添加NaCl后，肌原纤维蛋白凝胶的微观结构结合更加紧密。进一步通过皮尔森相关性分析，发现添加不同量的NaCl后肌原纤维蛋白凝胶特性与鱼糜凝胶特性具有一定的相关性。

综上所述，在鱼糜的生产加工过程中添加NaCl可以改善肌原纤维蛋白凝胶特性，进而改善鱼糜的品质，并为后续生产加工高品质鱼糜提供了思路。值得注意的是鱼糜凝胶特性的影响因素还有很多，今后仍需进一步研究。而且人们对食品的要求不仅包含美味，更要注重健康，因此在保证鱼糜制品品质的同时，仍应该控制NaCl的添加量，提高鱼糜制品的安全性。