伊曲康唑注射液无菌检查法的建立及方法优化研究

毕荣生

摘  要：目的：本次试验的目的在于通过对伊曲康唑注射液无菌检查法的建立及方法优化研究，选择出更加适合伊曲康唑注射液无菌控制的检查方法。方法：本次试验方法参照《中国药典》中的无菌检查法，筛选出伊曲康唑注射液的最优无菌检查法，选用三种溶液，分别为0.1%的蛋白胨水溶液、pH值为7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液以及0.9%的无菌氯化钠溶液作为冲洗溶液，应用薄膜过滤法，将多种菌种多为试验菌进行试验验证。通过这种方式形成三种试验方法，对伊曲康唑注射液进行无菌检查。结果：通过试验对比分析，可以看出方法2与方法1虽然冲洗溶液不同，但是检查效果相同，其中0.1%的蛋白胨水溶液成本要更低。方法3虽然所用冲洗量比较少，但是操作过程比较复杂，冲洗过程中容易出现结晶的情况，不便过滤，综合对比之后，建议选择方法1进行伊曲康唑注射液的无菌检查。结论：选择方法1进行伊曲康唑注射液的无菌检查，操作简单，结果更加准确可靠，值得推广应用。

关键词：伊曲康唑注射液;无菌检查法;薄膜过滤法

伊曲康唑注射液是比较常见的一种广谱抗真菌药，主要用于各种由致病菌导致的感染疾病的治疗。主要是通过抑制真菌细胞膜所需的麦角固醇的合成，破坏真菌细胞膜的形成，最终杀灭真菌。伊曲康唑注射液在治疗期间不会对身体其它功能器官造成损伤，治疗效果显著，安全性比较好。伊曲康唑注射液因为是用于真菌感染的治疗，因此对伊曲康唑注射液本身的无菌要求比较高，无菌检查是保证注射液安全无菌的重要途径。此前虽然已经有过对伊曲康唑注射液的无菌检查的研究，但是并不明确。本文根据要求，重新对伊曲康唑注射液的无菌检查方法进行优化研究，用3種不用的稀释溶液通过薄膜过滤法确定出最有效的无菌检查法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

WCP-600隔水式培养箱;LRH-250生化培养箱;HTY-2000封闭式集菌仪;HFsafe-760s型生物安全柜;KSF220集菌培养器。

1.2 菌种、样品

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。以上菌种均购自中国医学菌种保藏中心，试验用菌株均为第2代。样品为规格为25mL：0.25g的伊曲康唑注射液。

1.3 冲洗液与培养基

pH值为7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液，0.1%的蛋白胨水溶液，0.9%的无菌氯化钠溶液，营养肉汤培养基，硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁培养基，以上培养基适用性检查均符合《中国药典》2010年版二部附录要求。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养24h;接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，35℃培养24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25℃培养48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100CFU的菌悬液。接种黑曲霉菌至改良马丁琼脂斜面，25℃培养7d，用0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子，制成每1ml含孢子数小于100CFU的孢子悬液。结果见表1。

2.2 供试液制备

取伊曲康唑注射液样晶，去除外包装，以无菌操作方法消毒处理备用，接种每种培养基的检验数量为20支，检验量为12.5ml。

2.3 验证方法

2.3.1 试验管

试验管中取供试液，采用薄膜过滤法，用0.1%蛋白胨水溶液为冲洗液：冲洗500mL/膜，100mL次作为方法1;pH7.0氯化钠蛋：白胨缓冲液为冲洗液冲洗500mL/膜，100mL/次作为方法2;每支伊曲康唑注射液以50mL0.9%无菌气化钠溶液稀释，薄膜过滤，再以0.9%无菌氯化钠溶液为冲洗液，冲洗500mL/膜，100mlL/次作为方法3，进行处理过滤试验，最后一次冲洗液中加入少于100CFU的试验菌。过滤后每个培养管内灌注培养基，培养观察5d。硫乙醇酸盐流体培养基置30-35℃培养，改良马丁培养基置23～28℃培养，观察5d，结果见表2。

2.3.2 对照管

不加入供试液，按2.3.1试验管方法，同法试验，结果见表2。

2.4 判断方法

以上三种方法全都进行三次的平行试验，将供试品管中的试验菌与对照管中的试验菌进行比较，如果供试品管中的试验菌生长情况良好，那么就说明供试品在这种检验条件下的抑菌控制作用并不明显，可以对照该检查方法和条件进行无菌检查。反之，如果试验品中任何一个容器中的试验菌生长情况出现问题，生长缓慢或者不生长，就说明这种检验方式具有一定的抑菌作用，需要先将抑菌性去除，然后再进行重新验证，直至无抑菌作用，再进行无菌检查。

2.5 结果

本文所采用的三种试验方法，与对照管进行比对之后，可以看出试验菌中的菌种生长情况全部良好，检验验证通过，伊曲康唑注射液可以采用这三种方法进行无菌检查。方法1与方法2中所选用的冲洗溶液不同，但是试验效果相同，其中方法1中使用的0.1%蛋白胨水溶液成本相对更低。方法3虽然配制过程更相似，冲洗液用量也比较少，但是操作过程复杂，溶液容易出现结晶的情况，不容易过滤。根据对比分析结果来看，方法1更适用于伊曲康唑注射液的无菌检查。

3 讨论

本次试验所采用的0.1%蛋白胨水溶液，pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液以及0.9%无菌氯化钠溶液都可以用来作为冲洗溶液进行药品的无菌检测，但是作用的机制各不相同。其中0.1%蛋白胨水溶液中的蛋白胨营养物质丰富，利于微生物的生长和恢复;pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液除了含有与0.1%蛋白胨水溶液相同质量的蛋白胨之外，还有磷酸二氢钾以及氯化钠等多种无机盐，主要功能是用来维持细胞结构的组成、能量转移以及代谢的平衡，因为PH值比较稳定，营养物质丰富，有利于微生物的生长;0.9%无菌氯化钠溶液可以保证细胞中的渗透压稳定，避免细胞破裂。从冲洗效果来看，pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液的冲洗效果最好，但是成本也比较高，在使用方法1与方法2进行试验时，薄膜过滤之前不需要进行润膜这一环节，0.1%蛋白胨完全能够满足试验需求。方法3模拟了注射液在输液之前的配制程序，但是在过滤的时候发现有结晶产生，薄膜被堵塞，管中的压力上升，薄膜破损风险大，如果要用这一种方法进行无菌检查，必须要保证溶液能够充分稀释，过滤前后薄膜确保完好。方法1与方法2进行冲洗试验时，对白色念珠菌和黑曲霉菌等试验菌的抑菌性去除最低冲洗量分别为500mL/膜和100mL/次，对其它试验菌并没有发现抑菌性的产生，可以进行下一步的无菌优化试验。

参考文献

[1]姚华，李秋菲，李惠娥，等.伊曲康唑注射液无菌检查方法研究[J].中国药业，2009（03）：23-24.

[2]陈丽萍，杨晓莉，李辉.伊曲康唑注射液无菌检查法的建立及方法优化研究[J].药物生物技术，2016（1）：62-64，共3页.

[3]李秋菲，高飞，朱小红.伊曲康唑注射液无菌检查法的方法学研究[J].中国药业，2008（17）：9-10.