使细胞治疗成为攻克疾病的新一代技术手段——陈志国教授

李 默 韩德强 赵 宇 陈志国

(首都医科大学宣武医院细胞治疗中心, 北京 100053)

1 个人简介

陈志国教授(图1)，1977年11月出生于江苏省邳州市，首都医科大学宣武医院细胞治疗中心主任，万人计划科技创新领军人才。2012年获北京市海外高层次人才称号、北京市特聘专家，2015年获北京市科学技术一等奖(排名九)，2016年获牛顿高级学者奖，2018年获“科学中国人年度人物”。1999年毕业于南开大学生物化学与分子生物学系，后赴瑞典卡罗琳斯卡医学院攻读博士学位，研究领域为神经科学和免疫学。2004-2010年在斯坦福大学干细胞研究所进行博士后深造，致力于神经干细胞的调控机制以及胚胎干细胞和诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)在中枢神经系统疾病中的应用。2010年3月归国在首都医科大学宣武医院细胞治疗中心任职，2014年被聘为首都医科大学教授。就职期间主要在干细胞治疗神经退行性疾病的基础与临床转化研究以及抗肿瘤免疫治疗新技术研究方面取得了突出成绩。在细胞转分化治疗帕金森病的研究中，实现了细胞的跨胚层转化，可将人的皮肤细胞、外周血单个核细胞诱导为人诱导神经干细胞(human induced neural stem cell，hiNSCs)，为自体移植治疗帕金森病的临床应用开辟了新的途径。在抗肿瘤免疫治疗方面，2018年自主研发了具有选择性扩增活性的CD19特异性人源化CAR受体(CD19 hsCAR)，CD19hsCAR修饰性T细胞对鼠源CD19CAR-T治疗缓解后复发以及对鼠源性CD19CAR-T原发抵抗的急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)患者具有良好的临床疗效，为肿瘤患者带来福音。

图1 陈志国教授

陈志国教授先后主持国家“973”计划项目1项，国家重点研发计划干细胞与转化研究重点项目1项，国家自然科学基金7项(其中国家优秀青年科学基金1项、国际合作项目2项)，北京市自然科学基金1项，“长城学者”、“拔尖团队” 等北京市属人才项目；发表SCI论文57篇，相关研究成果发表在包括ClinicalCancerResearch、CellResearch、Theranostics、BrainBehaviorandImmunity、CellDeathandDisease、CellDiscovery等行业高水平期刊上(图2)。

图2 北京市科学技术奖获奖证书

2 主要学术贡献

2.1 帕金森病细胞治疗基础和临床转化研究

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常见的神经系统退行性疾病之一，国际流行病学调查显示,2005年中国大约有200万PD患者，预计到2030年中国的PD患者将接近500万，而全球的PD患者将超过870万。目前临床上没有能够彻底治愈帕金森病的方法，主要通过药物和手术缓解症状。症状初期通常采用多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂，随着患者症状加重给予左旋多巴对症治疗，疾病终末期药物无法控制症状时部分患者采用脑深层刺激术(deep brain stimulation, DBS)改善症状。大多数的帕金森病患者最终会出现自律神经疾患、睡眠障碍、认知功能减退等问题，这些症状(尤其是认知功能减退)是造成患者残障的主因。无论是药物治疗还是手术治疗，现有的治疗方式都无法从根本上治愈帕金森病，也无法阻止病情的进展。

PD的主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元发生退行性病变和丢失。补充缺失的多巴胺神经元的细胞治疗方法有望成为治疗帕金森病有效途径。20世纪80～90年代，欧洲和美国进行了一系列针对PD细胞移植治疗的临床研究，通过移植流产胎儿中脑腹侧的神经前体细胞到患者的纹状体，部分患者的运动功能可以得到长期恢复，移植的DA神经前体细胞在成年脑内可以分化成DA神经元，并释放DA。这些临床研究证明了细胞治疗在神经系统疾病中的巨大潜能。然而这些临床试验由于并未达到预期的终点试验要求而告终。早期临床研究失败的可能原因：一是流产胎儿脑组织来源有限且存在伦理学问题；另外对于PD患者来说这些移植的细胞为同种异体细胞，会刺激机体产生免疫排斥反应；最后，植入组织具有异质性，不仅含有DA神经细胞，也包含如5-羟色胺(serotonin，5-HT)神经细胞等其他类型的细胞。移植到脑内后，非DA细胞整合到神经环路中会产生不良反应。

将体细胞直接重编程为具有多能性的诱导多功能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)技术的问世，使得使用患者自体来源的细胞治疗PD成为可能，有可能解决流产胎儿组织所伴随的一些问题。然而，iPSCs制备和分化周期长，并存在一定程度潜在的致瘤性，这些因素限制了其在临床上的应用。神经干细胞(neural stem cells，NSCs)作为神经系统的成体干细胞，在PD治疗中具有很高的应用价值。然而，其来源的局限性和异基因移植可能引发免疫排斥反应限制了其在临床上的应用。陈志国教授团队及合作者借鉴了iPSCs的思路，创造性地完成了将体细胞不经iPSCs阶段直接重编程为iNSCs的成果。这项成果的意义在于为干细胞移植治疗PD拓展了新的细胞来源，使患者有可能利用自体来源且安全性高的细胞移植治疗帕金森病[1-2]。

之后，陈志国教授团队用非整合质粒载体将健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)诱导成为神经干细胞，此类细胞拥有神经干细胞特性，能分化成神经元、星型胶质细胞、多巴胺能神经元及少突胶质细胞等。在进一步的研究中，陈志国教授团队利用仙台病毒载体携带外源基因将成人外周血单个核细胞重编程为神经干细胞；鉴定了重编程得到的诱导神经干细胞的安全性，包括外源基因的沉默，仙台病毒载体的灭活，全基因组测序是否存在有害突变；在体外将诱导神经干细胞分化为DA神经元并确定细胞体内移植的最佳时间点；将诱导神经干细胞分化获得的DA神经前体细胞移植入免疫缺陷PD小鼠纹状体内，并通过动物实验证明了该细胞的安全性及有效性。成人外周血同皮肤成纤维细胞相比，取材更加简单、安全，患者接受的程度更高。这项成果具有巨大的临床应用前景和社会效益，目前已经获批专利[3-4]。

2.2 异基因神经干细胞移植引发宿主免疫识别的机制研究

目前干细胞移植治疗PD研究中使用的细胞来源大部分为同种异体细胞(异基因移植物)。然而，移植异基因的干细胞有可能会引起宿主体内的免疫反应，从而影响移植效果。因此，深入研究异基因移植物引发的免疫反应的机制对干细胞移植治疗PD今后的应用具有重要意义[5]。

图3 诱导神经干细胞制备技术路线

此外，陈志国教授团队和合作者成功将小鼠成纤维细胞直接转分化为具有功能的多巴胺能神经元(induced dopaminergic neuron，iDA)。通过使用不同的外源因子组合，可以获得表达多巴胺能神经元特异性标志物并具有电生理功能的iDA。这项成果为干细胞移植治疗帕金森病拓展了新的细胞来源，同时填补了跨胚层直接转分化的理论空白[2]。

2.3 干细胞移植治疗帕金森病在小动物和大动物模型上的应用

干细胞移植治疗帕金森病在开展临床试验前，必须在动物模型上完成安全性和有效性的验证。陈志国教授团队在此方向一直居于全国乃至世界的前列，取得了重要成果。陈志国教授团队成功完成了自体iPSCs获得的多巴胺能神经元移植治疗非人灵长类PD模型的工作。非人灵长类因其与人类的高度相似性，是干细胞治疗的临床前大动物在体研究极为理想的载体。该团队成功获得了成年食蟹猴的iPSCs，并将其分化为多巴胺能神经前体细胞。在将该食蟹猴制成帕金森病模型后，移植了自体多巴胺能神经前体细胞。经过6个月的观察，PD模型食蟹猴的行为学症状明显改善，且没有任何不良反应，安全性好,有大量细胞存活并分化为多巴胺能神经元。这项成果在理论上证明了自体来源iPSCs获得的神经前体细胞治疗PD的安全性和有效性，为今后利用自体iPSCs移植治疗PD的临床应用奠定了坚实的基础[6]。

陈志国教授团队还成功证明了表达胶质细胞来源神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的自体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)对非人灵长类PD模型的保护作用。这项成果为利用GDNF治疗帕金森病提供了新的方法，也为利用自体BMMSCs治疗帕金森病的临床应用提供了理论基础[7]。

2.4 具有体外定向扩增功能的人源化嵌合抗原受体修饰性T细胞(CD19 hsCAR-T)治疗技术

作为抗肿瘤免疫治疗领域的突破性细胞制剂，嵌合抗原受体修饰性T细胞在治疗血液性肿瘤方面取得了令人瞩目的成果，并成为应用于血液系统肿瘤治疗的又一种创新性生物制剂。然而，CAR-T在临床应用依然面临的诸多瓶颈。缓解后复发和原发性抵抗是其中两个尤为突出的问题。最新研究结果表明，接受了鼠源性CAR-T治疗后缓解的患者中，大约50%1年内复发；另外还有20%左右的人群在首次接受CAR-T治疗时没有响应[8-9]。而目前针对鼠源性CAR-T治疗后CD19阳性复发的患者再次输注CAR-T进行治疗的有效率性极低；进而限制了CAR-T在临床的进一步推广。

为解决上述难题，陈志国教授带领研究团队创新性的研发了一款具有选择性扩增活性的CD19特异性恰合抗原受体分子，CD19hsCAR(图4)。该分子将鼠源性CD19特异性嵌合抗原受体的抗原特异性识别结构域进行人源化改造，同时嵌入选择性结构域，在提高嵌合抗原受体对CD19靶点亲和力的同时，利用选择性结构域实现修饰性T细胞的体外定向扩增；一方面提高了CD19CAR-T对靶细胞的杀伤能力；另一方面通过体外二次选择性活化，提高了CD19CAR-T终产品的纯度，增强其记忆性细胞亚群的比例，延长其在体内的持久性(图5)。此外，通过人源化改造，降低了鼠源性CD19CAR的免疫排斥风险，提高了其临床应用的安全性，解决了鼠源性CD19CAR-T输注后复发且多次输注无效的技术瓶颈，提高了CD19CAR-T临床应用的适用性[10]。

图4 CD19hsCAR结构示意图

图5 CD19hsCAR-T体内抗肿瘤活性研究

目前，该项目已经完成了Ⅰ期临床研究(注册号：ChiCTR 1800017439、ChiCTR1800014761)，同时与首都医科大学附属北京儿童医院开展了Ⅱ期临床研究(注册号：NCT03902197)。临床研究表明，CD19hsCAR-T对于鼠源性CD19CAR-T治疗后复发或无效的患者的有效率为80%，且临床安全性良好，该阶段性成果发表在ClinicalCancerResearch杂志上(5年IF=9.5)。同时该技术也申请了多项国内和国际专利，其中国内发明专利的已授权2项(国内专利授权号：ZL2018100685628，ZL201910510234.3)，并正在进行成果转化工作的推进。

2.5 以iNSC为药物递送载体的新型抗肿瘤细胞制剂的研发

基于在干细胞领域取得的多项突破的基础上，陈志国教授还创新性地利用诱导神经干细胞针对肿瘤组织的特异性归巢能力，正在研发一款携带抗肿瘤效应分子的iNSC特异性抗肿瘤细胞制剂。该制剂利用以健康人外周血单个核细胞为种子细胞制备的iNSC为效应细胞，通过基因修饰的手段让其共表达TNF-α和TK两种抗肿瘤活性分子，开展针对神经胶质母细胞瘤的临床前研究及疗效评估工作。该项工作获得了国家自然科学基金面上项目的资助，相关研究工作正在进行中。