ABMSCs移植联合关节镜清理术对KOA患者疼痛程度、膝关节功能及炎性因子的影响

王 力，张净宇，刘建华，赵海勇，温 芳，游 洋，丁红梅

膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是一种常见的慢性退行性疾病，随病程延长，膝关节功能会逐渐丧失，最终导致残疾[1]。既往KOA早期治疗以物理及药物治疗为主，旨在延缓病情进展、减轻临床症状，晚期则可考虑行膝关节置换术。既往对药物、物理治疗无效，临床评估病变尚无需行关节置换术者，关节镜清理术是其最为有效的治疗手段，可清除软骨碎屑、降解颗粒及各种炎性因子，并可调节关节液酸碱度与渗透压，改善关节内环境与软骨营养供给，延缓病程进展[2]。但关节软骨属透明软骨，内部无神经、血管及淋巴管分布，未分化细胞无法进入并修复损伤部位，且软骨细胞包埋于致密的胶原-蛋白多糖基质中，限制了细胞增殖和迁移能力，使得软骨细胞基质的合成能力受限，无法满足组织修复需要。随细胞生物理论和对KOA病因病理研究的不断深入，使得干细胞技术治疗KOA成为可能。自体骨髓间充质干细胞(ABMSCs)因具有免疫抑制活性、多向分化潜能及易培养等特点，近年逐渐应用于膝关节软骨损伤的治疗[3]。研究显示，ABMSCs具有高度自我更新能力和多向分化潜能，体外不同条件诱导下可分化为不同组织，有效修复受损软骨组织[4]。但目前关于ABMSCs移植联合关节镜清理术治疗KOA的报道较少，故而本研究在行关节镜清理术基础上联合ABMSCs移植治疗KOA，探讨其临床治疗效果以及对患者疼痛、膝关节功能、炎性因子的影响。

1 对象与方法

1.1纳入与排除标准

1.1.1纳入标准：①符合KOA诊断标准[5]；②Kellgren-Lawrence(K-L)分级Ⅱ～Ⅲ级；③单侧患病；④具有关节镜清理术和ABMSCs移植治疗适应证；⑤无其他系统严重器质性病变。

1.1.2排除标准：①膝关节严重畸形或存在关节游离体者；②合并风湿及类风湿性关节炎、创伤性关节炎、痛风性关节炎者；③合并严重肝肾功能不全、凝血功能异常者；④正接受药物等其他方法治疗者；⑤伴膝关节急性创伤或感染、局部皮肤破溃者；⑥有膝关节手术史者；⑦伴精神异常、认知障碍者。

1.2对象及方法 选取我院2017年10月—2019年2月收治的110例KOA患者，其中男60例，女50例；年龄45～73(64.8±5.1)岁；病变侧别：左膝37例，右膝73例；病程3个月～3年，平均(1.42±0.65)年；K-L分级：Ⅱ级32例，Ⅲ级78例。所有患者据治疗方法不同分为观察组57例和对照组53例。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过。

1.3治疗方法 两组均行关节镜清理术，观察组在此基础上联合ABMSCs移植治疗。

1.3.1对照组：对照组予膝关节镜清理术，完善术前准备，连续硬膜外麻醉，麻醉起效后患者取平卧位，常规消毒铺巾，自患膝关节前内、外做一约5 mm切口，后置入关节镜，全面探查患膝关节，逐一清理关节病变组织，视病情情况松解或部分切除髌下肥厚脂肪组织与内侧滑膜嵌顿组织，部分切除炎症较重的增生肥厚滑膜组织，同时处理合并的半月板损伤。术后用0.9%氯化钠注射液充分冲洗关节腔，逐层缝合切口并无菌敷料包扎。

1.3.2观察组

1.3.2.1血小板裂解液(PL)制备：关节镜清理术前1周抽取自体空腹静脉血300 ml，1000 r/min离心10 min取上清，-20℃冰箱过夜后再于-80℃冰箱冻存12 h后取出，置于37℃水浴锅中融化3 min，后以1000 r/min离心4 min所获上清液即为PL。将获得的PL中加入氯化钙2 mg/ml和凝血酶28 U/ml，混匀后37℃培养6 d，1000 r/min离心5 min，获得的上清液即为激活的PL液，置于-80℃冰箱内保存备用。

1.3.2.2ABMSCs分离培养：行关节镜清理术的同时，消毒患者髂后上棘，穿刺注射器抽取骨髓血60 ml。采用密度梯度离心法分离骨髓血中ABMSCs，采用贴壁培养法在DMEM培养基中培养，2～3 d换培养液1次。培养第8日用0.25%胰蛋白酶消化后行传代培养、纯化，取第2代细胞分装于-80℃冰箱冷冻备用。

1.3.2.3ABMSCs移植：观察组在关节镜清理术后1个月行ABMSCs移植，关节镜清理术方法同对照组。移植术前1周于患膝关节腔内注射激活的PL液3 ml，移植术前3 d取冻存的第2代ABMSCs培养，移植当日以0.25%胰蛋白酶收集ABMSCs，1000 r/min离心6 min弃上清后取激活的PL液3 ml重悬。患者取仰卧位，常规膝关节腔穿刺抽取关节积液，拔下注射器针管，留置针头接装有ABMSCs悬液的注射器，缓慢注入患膝关节腔内2 ml。注射完毕后无菌纱布按压针眼3～5 min，俯卧位保持30 min，每5 min屈伸活动膝关节8～10次。移植术后1周再次关节腔穿刺注射激活的PL液3 ml。

1.4观察指标

1.4.1疗效评定[6]：治疗后半年比较两组疗效。临床控制：关节疼痛、肿胀等症状消失，关节功能基本恢复正常；显效：关节疼痛、肿胀等症状显著缓解，关节功能明显好转；好转：关节疼痛、肿胀等症状有所缓解，关节功能有所好转；无效：关节疼痛、肿胀等症状及关节功能均无好转或加重。总有效率=(临床控制+显效+好转)例数/总例数×100%。

1.4.2疼痛程度：治疗前及治疗后3、6个月，采用视觉模拟评分法(visual analogue scale， VAS)评价两组疼痛程度，总分0～10分，得分越高表示疼痛程度越严重[7]。

1.4.3膝关节功能：治疗前及治疗后3、6个月采用Lysholm膝关节评分量表(Lysholm knee score scale， LKSS)评价两组患膝关节功能恢复情况，总分100分，得分越高表示膝关节功能恢复越好[8]。

1.4.4关节液炎性因子：治疗前及治疗后3、6个月，采用酶联免疫吸附法检测两组患膝关节液白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

1.4.5治疗后半年两组并发症

2 结果

2.1临床疗效比较 观察组治疗总有效率为91.23%高于对照组的71.70%(χ2=7.042，P=0.008)。见表1。

2.2治疗前后疼痛VAS评分比较 两组治疗后VAS评分逐渐降低，治疗后3、6个月VAS评分均较治疗前降低，且观察组治疗后3、6个月VAS评分均低于对照组同时间，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 不同方法治疗的膝骨关节炎两组治疗前后疼痛视觉模拟评分法评分比较分)

2.3治疗前后LKSS评分比较 两组治疗后LKSS评分逐渐升高，治疗后3、6个月LKSS评分均较治疗前升高，且观察组治疗后3、6个月LKSS评分均高于对照组同时间，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 不同方法治疗的膝骨关节炎两组治疗前后Lysholm膝关节评分量表评分比较分)

2.4治疗前后关节液炎性因子比较 两组治疗后IL-1β、TNF-α逐渐降低，治疗后3、6个月IL-1β、TNF-α均低于治疗前，且观察组治疗后3、6个月IL-1β、TNF-α亦低于对照组同时间，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 不同方法治疗的膝骨关节炎两组治疗前后关节液炎性因子比较

2.5并发症发生情况 治疗后半年，两组均未出现关节红肿、发热等局部感染和其他不适。

3 讨论

KOA的发生与衰老、炎症、超负荷运动、骨质增生、遗传、肥胖、环境等多种因素有关，在上述因素影响下可致膝关节软骨发生慢性、无菌性、进行性改变，关节活动受到明显限制，从而严重影响患者生活质量[9]。目前尚无有效药物能阻止KOA病情进展，随病程进展，最终需行人工关节置换术，然而该术存在血栓、感染等风险且费用昂贵，极大增加了患者经济负担。关节镜清理术目前主要用于药物治疗无效且又不具有关节置换适应证的KOA患者，可调节关节液酸碱度与渗透压，改善关节内环境与软骨营养供给情况，延缓病程进展[10]。但关节软骨属透明软骨，内部无神经、血管及淋巴管分布，未分化细胞无法进入并修复损伤部位，且软骨细胞包埋于致密的胶原-蛋白多糖基质中，限制了细胞的增殖和迁移能力，使得软骨细胞基质的合成能力受限，无法满足组织修复的需要。随着细胞生物理论和对KOA病因病理研究的不断深入，使得干细胞技术治疗KOA成为可能。

间充质干细胞广泛分布于骨髓及脂肪组织中，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化的潜能，且易于获取[11]。梁建基等[12]对骨性关节炎患者采用关节腔注射ABMSCs治疗，显著改善了关节疼痛及僵硬症状，有效促进了病变关节功能恢复。动物实验也显示ABMSCs可抑制骨关节炎模型动物的炎性反应，降低软骨基质降解速度，促进新生软骨生成与基质分泌，减轻滑膜增生，抑制骨赘形成[13]。

研究表明，胰岛素样生长因子-1、白细胞介素-1等多种细胞因子参与了软骨细胞的分裂、生长、成熟与老化过程，KOA的发生即是因上述细胞因子平衡被打破，使其朝软骨分解的方向进行所致[14]。我们在ABMSCs移植术前及术后注射PL液，可纠正关节软骨合成与分解失衡，PL液中含有血管内皮细胞生长因子，可促进局部血管形成，改善局部血液供应，促进ABMSCs向软骨细胞转化。本研究结果显示：观察组治疗总有效率为91.23%高于对照组的71.70%；两组治疗后VAS评分逐渐降低，治疗后3、6个月VAS评分均较治疗前降低，且观察组治疗后3、6个月VAS评分均低于对照组同时间；两组治疗后LKSS评分逐渐升高，治疗后3、6个月LKSS评分均较治疗前升高，且观察组治疗后3、6个月LKSS评分均高于对照组同时间。研究显示，退行性骨关节环境为酸性及低氧环境，其中含有大量的炎症介质，可引起软骨破坏，抑制软骨再生，影响ABMSCs的增殖和分化[15]。在KOA发病与发展过程中，IL-1β、TNF-α通过介导多种炎性反应参与机体免疫调节，诱发软骨细胞凋亡与细胞外基质降解，在关节软骨破坏初始阶段起很大作用[16]。本研究发现，两组治疗后IL-1β、TNF-α逐渐降低，治疗后3、6个月时IL-1β、TNF-α均显著低于治疗前，其中观察组各项炎症介质水平与对照组同时点相比均有明显降低。

综上，ABMSCs移植联合关节镜清理术治疗KOA效果显著，可显著缓解患者疼痛，促进患膝关节功能恢复，有效抑制患膝关节液炎症介质释放，且安全性良好。