蓝莓酶解工艺优化研究

戴意强 吴寒 单成俊 刘小莉 王英 臧泉 周剑忠 夏秀东

摘要：为提高蓝莓出汁率和果汁中花色苷含量，以酶的种类、酶解时间、酶解温度和酶的添加量为对象，研究其对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。通过单因素试验研究蓝莓出汁率和花色苷含量对各因素的依赖关系，并采用响应曲面法进行优化，结果表明，提高蓝莓出汁率和花色苷含量的最佳工艺为酶解时间3 h，酶解温度 54.5 ℃，酶的添加量4.8‰，在此条件下蓝莓出汁率和花色苷含量分别为70.95%和44.94 mg/L。

关键词：蓝莓;出汁率;花色苷含量;响应曲面;酶解工艺

中图分类号： TS255.36  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0219-06

蓝莓（Vaccinium uliginosum）属于杜鹃花科越橘属，原产于北美和欧洲地区[1]。蓝莓被称为“长寿水果”，具有很强的抗氧化能力，可以清除自由基，被人们认为是所有水果和蔬菜中抗氧化剂的最大来源之一[2]。蓝莓果实含有丰富的蛋白质、食物纤维、糖分、维生素、矿物质、花色苷等[3]。在常见含有花色苷的果蔬中，蓝莓花色苷含量最高[4]，具有抗氧化、保护视力、预防治疗癌症、预防心脑血管疾病和提高记忆力等功能[5-10]。

蓝莓的成熟正值夏季，且生产时间集中，果实不耐储藏，因此常常被加工成果汁、果酒、果酱等制品。目前的果蔬加工业中，常常会加入酶类以提高果蔬汁的出汁率及内容物的溶出，其中应用最广泛的是添加果胶酶[11]。现有的研究普遍使用单一酶加入到果蔬中或者仅仅将出汁率作为指标进行试验，本试验利用果胶酶和纤维素酶对蓝莓进行酶解，以出汁率和花色苷含量作为评价指标，通过单因素试验和响应曲面优化，确定最佳的蓝莓汁生产工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蓝莓来源于南京市溧水区白马种植基地;果胶酶（≥40 units/mg solid）和纤维素酶（≥50 units/mg solid）购于上海蓝季生物公司。

1.2 试剂与仪器

试剂：KCl，国药集团化学试剂有限公司生产;NaAc，南京化学试剂股份有限公司生产。

仪器：离心机3K15，SIGMA生产;数显恒温水浴锅HH-4，国华电器有限公司生产;破壁多功能料理机，爱纳福电器有限公司生产;酶标仪Epoch，美国伯腾仪器有限公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓汁的制作工艺 蓝莓→清洗→沥干→破碎打浆→加酶→保温酶解→离心（5 000 r/min，15 min）→收集上清→成品。

1.3.2 蓝莓酶解单因素试验 （1）酶的种类对蓝莓出汁率及花色苷的影响。果胶酶和纤维素酶按 1 ∶ 1 的比例添加，添加量为3‰，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，考察酶的種类（不添加酶，添加果胶酶，添加纤维素酶，添加果胶酶和纤维素酶）对蓝莓出汁率及花色苷的影响。（2）酶的添加量对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。添加果胶酶和纤维素酶，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，考察酶的添加量（1‰、2‰、3‰、4‰、5‰）对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。（3）酶解温度对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。添加果胶酶和纤维素酶，酶的添加量为3‰，酶解时间为2 h，考察酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。（4）酶解时间对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。添加果胶酶和纤维素酶，酶的添加量为3‰，酶解温度为50 ℃，考察酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。

1.3.3 酶解效果指标的测定 （1）出汁率的测定：分别称取蓝莓果浆和离心后收集的上清液，按以下公式计算出汁率：出汁率=上清液质量/蓝莓果浆质量×100%。（2）花色苷的测定：参照兰永丽的报道方法[12]进行测定。取2份同一试样0.1 mL，分别加入0.2 mol/L的KCl（pH值1.0）和0.2 mol/L的NaAc（pH值4.5）0.9 mL，静止平衡1 h后，分别测定样品在510 nm和700 nm处的吸光度。花色苷含量计算公式：花青素含量=ΔD×MM×D×1 000/ε。式中：ΔD代表[（D510 nm-D700 nm）pH1.0-（D510 nm-D700 nm）pH4.5]，mg/L;MM代表矢车菊素-3-葡萄糖苷分子质量449.2;D代表稀释倍数;ε代表矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数26 900。

1.3.4 响应曲面优化试验设计 由单因素试验结果，依据Box-Behnken设计原理，以蓝莓出汁率和花色苷含量为响应值，选取酶的添加量、酶解温度、酶解时间设计响应曲面试验，优化蓝莓汁制作的工艺参数，试验因素及水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶的种类对蓝莓果浆出汁率及花色苷含量的影响 蓝莓果实的细胞间层和细胞壁之间存在着果胶，果胶会影响、阻碍蓝莓中有效成分的释放[13]，而果胶酶的加入可以使蓝莓渣中果胶物质进一步分解，提高出汁率和促进花色苷等物质的释放。木质纤维素生物质能抵抗微生物破坏和一些物理化学损伤，纤维素酶可以破坏木质纤维素生物质结构，使得内容物流出[14-15]。由图1可知，与不添加酶相比，单独添加一种酶后的蓝莓出汁率无显著增加，但果胶酶和纤维素酶联合作用的蓝莓出汁率显著增加（P<0.05）。与不添加酶相比，通过添加果胶酶和纤维素酶，蓝莓汁的花色苷含量显著增加（P<0.05），这是因为果胶酶和纤维素酶使蓝莓果胶和纤维素等物质水解，进而有效成分如花色苷充分溶出，且花色苷的含量与产品的颜色呈正相关[16]，有助于增强消费者的认同感。果胶酶和纤维素酶共同加入的蓝莓出汁率和花色苷含量分别为63.45%和41.94 mg/L。因此选择蓝莓中添加果胶酶和纤维素酶有助于出汁率和花色苷含量的提高。

2.1.2 酶解时间对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响 由图2可见，随着酶解时间的增加，蓝莓的出汁率和花色苷含量先持续增加后趋于平稳。酶的作用促使蓝莓果肉组织和细胞壁结构发生了破坏，当酶解时间为2.5 h时，出汁率和花色苷含量均达到最大值，分别为65.27%和41.90 mg/L，此时蓝莓内容物已基本溶出。

2.1.3 酶解温度对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响 酶的最适温度不仅能保持酶自身的热稳定性和维持自身结构稳定性，还能通过影响酶活性位点的亲和力来影响酶的活性。由图3可知，当温度从40 ℃上升至55 ℃时，蓝莓的出汁率和花色苷含量显著上升（P<0.05）;当酶解温度为55 ℃时，蓝莓出汁率和花色苷含量分别为 65.45% 和 43.31 mg/L，相较于40 ℃时蓝莓的出汁率和花色苷含量，分别上升了7.44%和13.24%。当温度上升至60 ℃时，蓝莓出汁率显著降低（P<0.05），但蓝莓汁中花色苷含量保持平稳，这是因为温度上升影响了果胶酶和纤维素酶的活性，而适当的温度可以提高花色苷的溶出率，抑制过氧化物酶、多酚氧化酶等可以降解花色苷的酶的活性。

2.1.4 酶的添加量对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响 将果胶酶和纤维素酶按1 ∶ 1的比例添加到蓝莓果浆中，其对蓝莓果汁出汁率和花色苷含量的影响如图4所示。适当的酶添加不仅可以提高蓝莓的出汁率，而且还可以释放结合态花色苷，提高蓝莓汁的颜色和抗氧化程度。随着酶添加量的增加，蓝莓的出汁率和花色苷含量先增加后趋于平稳，这与张晓旭等的研究结果[17]一致。当酶的添加量为4‰时，蓝莓果浆的出汁率和花色苷含量分别为64.33%和41.11 mg/L。选择酶的添加量为4‰时，既可以保证产品的得率和品质，又可以减少生产成本。

2.2 响应曲面试验结果分析

2.2.1 响应曲面试验结果 在单因素的基础上，向蓝莓汁的制作过程中添加果胶酶和纤维素酶，以蓝莓的出汁率（Y1）和蓝莓汁花色苷含量（Y2）作为试验设计的响应值，酶的添加量（A）、酶解温度（B）和酶解时间（C）为自变量，设计响应曲面试验，结果见表2。对表2的试验数据进行多元回归拟合，得到蓝莓出汁率和花色苷含量的二次多项回归方程为式（1）和式（2），其中Y1为出汁率，Y2是花色苷含量，A为酶解时间，B为酶解温度，C为酶的添加量。

2.2.2 响应曲面方差分析 模型的方差分析见表3和表4。P值大小衡量了模型的各个因素的显著性水平。由表3可知，P<0.01，表明关于出汁率的模型高度显著，F值为41.63，也表明二次模型高度显著。在模型中，一次项A和二次项A2、B2影响显著。失拟值为0.87，在α=0.01或α=0.05下不显著，因变量和全体自变量之间的线性关系极显著（R2=0.98）。由表4可知，P<0.05，表明关于花色苷含量的模型显著，F值为6.51，也表明二次模型显著。在模型中，一次项B和二次项B2以及交叉项AB为影响显著。失拟值为1.46，在α=0.01或α=0.05下不显著，因变量和全体自变量之间的线性关系显著（R2=0.89）。

通过方差分析，结合3个因素的平方值可以得到3个因素对出汁率的影响次序为酶解时间>酶的添加量>酶解温度，而3个因素对花色苷含量的影响次序为酶解温度>酶解时间>酶的添加量。

2.2.3 响应曲面交互作用分析 响应曲面（等高线图和3D图）可以直观地反应试验中不同因素对蓝莓出汁率和蓝莓花色苷含量的影响，以及两两因素之间交互作用对蓝莓出汁率和花色苷含量的影响。各因素之间的交互作用对蓝莓出汁率和花色苷含量如图5至图10所示。

由图5至图7等高线图可知，酶的添加量为4‰时，酶解时间一定，蓝莓的出汁率随着酶解温度的升高呈現先增加后降低的趋势;酶解温度为55 ℃时，酶解时间一定，蓝莓出汁率随酶的添加量的增加而上升;酶解时间为2.5 h时，酶解温度一定，蓝莓的出汁率随酶的添加量的增加而上升。由图5至图7的3D曲面平滑程度可知，酶解时间和酶解温度、酶解时间和酶的添加量、酶解温度和酶的添加量两因素的交互作用不明显。

由图8至图10等高线图可知，酶的添加量为4‰时，酶解时间一定时，蓝莓汁的花色苷含量随酶解温度的上升呈现先上升后降低的趋势;酶解温度为55 ℃时，酶解时间一定时，蓝莓汁的花色苷含量随酶的添加量的增加呈现上升趋势;酶解时间为2.5 h时，当酶解温度一定时，蓝莓汁的花色苷含量随酶的添加量的增加呈现上升趋势。由图8至图10的3D曲面陡峭程度可知，酶解时间和酶解温度两因素交互作用明显，酶解时间和酶的添加量、酶解温度和酶的添加量两因素的交互作用不明显。

2.2.4 模型验证试验 通过 Design Expert 中心组合法的优化分析可得最高出汁率和花色苷含量条件分别为酶解时间3 h、酶解温度54.67 ℃、酶的添加量4.86‰和酶解时间3 h、酶解温度54.41 ℃、酶的添加量5‰。考虑到生产工艺和生产成本，选取条件为酶解时间3 h、酶解温度54.5 ℃、酶的添加量4.8‰。进行3次平行试验，其蓝莓出汁率和花色苷含量分别为70.95%和44.94 mg/L，与预测值（70.27%和44.58 mg/L）相比，相对误差分别为0.95%和0.80%，说明该响应面模型与实际拟合结果较好，该模型可靠。

3 结论

本试验在单因素的基础上，根据Box-Benhnken设计相应曲面试验，建立了蓝莓出汁率和花色苷含量的二次多项式回归模型，优化蓝莓出汁和花色苷提取的工艺参数。本试验模型拟合程度高，能够对反应进行预测，模型方差分析中，模型P<0.05，表明该模型显著。模型给出的最优工艺参数为酶解时间3 h、酶解温度54.5 ℃、酶的添加量4.8‰，该条件下蓝莓出汁率和花色苷含量分别为70.95%和44.94 mg/L。

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