云南石屏汉族与彝族患者外阴阴道念珠菌病的菌种构成

高 飞， 郑永钦，曹 萍，贺军栋，杨稳莉 ，梁舒雯， 姚 岚， 撒亚莲*

[1.云南省第一人民医院(昆明理工大学附属医院)a皮肤科;b临床基础研究所;c核医学科,云南 昆明650032；2.石屏县人民医院 妇科; 3.昆明市中医医院 针灸科]

外阴阴道念珠菌病(VVC)是一个重要的公共卫生问题[1],每年数百万妇女受其困扰。已有研究表明，念珠菌的不同菌种对抗真菌药的敏感性、耐药性不同[2]。因此对菌种的鉴定非常重要。菌种鉴定的研究表明，真菌的ITS核苷酸较少出现变异，与权威数据库中的标准序列比对，当ITS区段核苷酸序列出现3%的阈值变化时，被视为新的菌种[3]。本研究采用科玛嘉显色培养法初步鉴定云南省石屏县汉族和彝族VVC人群的念珠菌样本，通过PCR扩增真菌ITS1-ITS4片段测序后进行念珠菌菌种鉴定。旨在了解石屏县彝族VVC患者携带念珠菌的菌种构成情况，为民族聚居区卫生组织制定诊治策略提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料143份样本由2017年3月至2018年4月到云南省石屏县人民医院和石屏县妇幼保健院经培养确诊为念珠菌阳性的VVC患者提供。汉族患者的平均年龄34.00岁(16-49)；彝族患者的平均年龄32.00岁(16-50)。标准菌株由中国科学院微生物研究所白逢彦教授惠赠(CGMCC 2.1801 季也蒙念珠菌，CGMCC 2.1846 近平滑念珠菌，CGMCC 2.1857 克柔念珠菌，CGMCC 2.1975 热带念珠菌，CGMCC 2.2086 白色念珠菌，CGMCC 2.2498 光滑念珠菌 )。离心机(Hitachi,CR22G)；PCR仪(ESCO AeristmG-96 well)；电泳槽和电泳仪(BG-Power 600i)；凝胶电泳成像分析系统(Bio-Rad ChemiDoc XRS)；电热恒温三用水箱(北京市永光明医疗仪器厂，HH-W21 600型)；测序仪为ABI 3730XL。科玛嘉念珠菌显色培养基购自郑州博赛生物技术股份有限公司，沙氏培养基为我科真菌室配置，电泳所需试剂购自北京百泰克生物公司，PCR扩增试剂(2X Taq PCR MasterMix)购自北京天根生化科技公司，DNA marker购自昆明丰科生物科技公司，PCR引物由昆明硕擎生物科技公司合成。

1.2 方法标本收集后立即接种科玛嘉显色平皿，选择有奶酪样菌落生长者，其中汉族患者来源84株，彝族患者来源59株，共143株。

1.2.1 科玛嘉显色培养基检测将采集到的143份样本接种在沙氏培养基，36℃孵育箱中培养5 d(48-72 h)，转种于科玛嘉显色平皿，置于30℃孵育箱中培养24-48 h后，观察菌株颜色，根据颜色情况，鉴定菌种。

1.2.2 煮沸法制备DNA模板[4]取培养平板上的菌落到有去离子水的1.5 ml离心管中，充分悬浮菌体。置100℃沸水中煮沸10 min，10000 rpm离心5 min后取上清液1-2 μl作为PCR扩增模板。

1.2.3 PCR扩增目的基因片段PCR扩增体系为25 μl，含2X Taq PCR MasterMix 12.5 μl，10 μmol/L上游、下游引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各1.0 μl，模板DNA 1 μl(50-100 ng)。 扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火35 s,72℃延伸60 s，30个循环；72℃充分延伸7 min，4℃保存。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.4 PCR产物直接测序将PCR扩增产物送华大基因公司进行测序，测序引物与PCR扩增引物相同。对PCR 产物用酒精沉淀法纯化，经Bigdye测序反应，用ABI 3730XL测序仪进行测序，测序结果采用DNAStar软件分析，经BLAST进行序列的同源性分析，在BLAST时设置了参考菌种模式菌株(type strain)，根据99%以上符合率鉴定菌种。

2 结果

2.1 科玛嘉显色培养基检测的结果通过与标准菌株比较，143例VVC患者来源的样本经科玛嘉显色培养基检测法检测，观察到翠绿色的白色念珠菌113株，铁灰蓝色的热带念珠菌1株，淡紫色的光滑念珠菌18株，粉红色的克柔念珠菌6株(图1b)。

图1 科玛嘉显色培养基人工判定结果

2.2 目的片段的PCR扩增产物对143例VVC患者来源的念珠菌基因组DNA进行PCR扩增，均得到特异性的目标条带，其片段大小与预期结果相一致(图2)。

1泳道为Marker DL2000,2-7泳道分别为念珠菌标准株(依次为白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌),8-12泳道为临床样本,blank为阴性对照。

图2 含目的片段的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

2.3 测序结果分析将143份含ITS1-ITS4区段的PCR扩增产物直接测序获取核苷酸序列，用DNAStar软件观察测序获取的峰图(图3)，将样本的核苷酸序列与标准菌株BLAST序列比对，同源性(相似度)在99%以上为同一个菌种。

2.4 念珠菌菌种在石屏县汉族和彝族中的构成测序法在VVC阴道分泌物中检测出5种菌种，汉族与彝族检出情况见表1。汉族与彝族VVC患者携带念珠菌的菌种分布差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 云南省石屏地区汉族与彝族患者VVC患者中念珠菌属的菌种构成

2.5 科玛嘉显色培养基法与测序法的检测结果比较石屏县143例VVC患者的念珠菌样本，通过科玛嘉显色培养基法与测序法检测，得到的菌株信息见表2。

表2 143例念珠菌样本基因测序鉴定结果与显色培养鉴定结果对比

3 讨论

本研究采用科玛嘉显色培养基法和PCR扩增产物直接测序法鉴定石屏县143例VVC患者样本中念珠菌的菌种构成，结果提示石屏县VVC患者的主要致病菌种是白色念珠菌，其次是光滑念珠菌，再次是近平滑念珠菌，而热带念珠菌、季也蒙念珠菌极少；念珠菌的菌株构成比在石屏县汉族和彝族患者中的分布无统计学差异。与测序法比较，科玛嘉显色培养基检测法的特异性差。

科玛嘉显色培养基法是针对常见的四种念珠菌在培养后样本的颜色改变来确定菌种，但从已有的实践经验看，科玛嘉显色培养基法对翠绿色为白色念珠菌，铁灰蓝色为热带念珠菌能准确判读，但对于粉红色、浅紫色的光滑或克柔菌种难以鉴定。例如：光滑念珠菌的浅紫色与克柔念珠菌的粉红色就不容易确定，即使经验丰富的技术员，也不能保证百分之百的准确。随着科技进步，多学科知识的渗透，新型检测技术让临床工作中真菌鉴定难题得以迎刃而解。

图3 为不同菌种特征性片段的测序峰图。3a、3b、3c、3d、3e分别是光滑念珠菌、白色念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌、近平滑念珠菌的核苷酸序列。

当前，念珠菌菌种鉴定方法有：基因多位点测序分型(MLST)[5]，联合ITS1-ITS4和D1/D2扩增片段测序分型[6]，根据蛋白组学特征的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS[7,8])，其次是传统生物学显色鉴定包括API和科玛嘉显色培养基检测等多种方法。已有的研究表明，从VVC患者宫颈分泌物中提取真菌DNA，PCR扩增含ITS1-ITS2片段的扩增产物直接测序法，是兼顾了准确性、经济成本和可操作性的快速分子检测方法，无论是特异性、敏感性还是时效性都明显优于传统培养法[9]。我们的研究结果提示，石屏地区的VVC患者携带的致病菌仍以白色念珠菌为主，非白色念珠菌(NAC)中以光滑念珠菌为主，其他NAC也有增长趋势[2,9-15]。其与刘华等人的研究结果相一致[2,10-15]。但也有研究报道，在不同地区和人种，VVC患者的致病菌以光滑念珠菌为主[1,16,17]。

念珠菌菌种的精准鉴定可以指导治疗。白色念珠菌对大多数唑类敏感，治疗首选唑类抗真菌药[2,6]。而大多数非白色念珠菌对唑类抗真菌药物耐药[10,17,18]。尤其是难治性VVC、复发性VVC患者，若发现病原菌为NAC，应根据体外药敏结果适当调整方案[2]。 因此，明确VVC患者携带念珠菌的菌种，有利于临床治疗用药的合理选择和医疗质量的提升。本研究纳入样本量少，研究结果是否有代表性，有待于扩大样本来研究证实，并进一步完成药敏/耐药试验,探讨不同民族致病菌株的药敏/耐药是否存在差异。依据每个患者分离菌株鉴定结果和体外药敏结果，实现个体化诊治，旨在为民族聚居区卫生管理部门制定诊治策略提供重要信息。

综上所述，云南省石屏地区的汉族及彝族VVC患者携带的念珠菌菌株的构成比差异无统计学意义，均以白色念珠菌最为常见。针对IIS1-ITS4基因片段的PCR扩增产物测序法能准确鉴定念珠菌的菌种，而科玛嘉显色培养基检测法缺乏特异性。