加味大承气汤活血攻下法治疗肠梗阻的网络药理学研究

张 涛， 杨成城， 张少辉， 门斯烨， 安佳琳， 李 权， 钱嘉惠， 周春宇

肠梗阻是指存在肠内容物通过障碍，伴有腹痛腹胀、恶心呕吐，停止排气排便的一种常见外科急腹症。本病如未得到及时救治，将引起水电解质紊乱、酸碱失衡、腹腔感染、急性腹膜炎、休克甚至危及生命。按照发病原因可分为机械性肠梗阻、动力性肠梗阻、血运性肠梗阻和假性肠梗阻[1]。本病的常规治疗分为手术治疗和保守治疗，其中手术治疗主要适用于急性绞窄性肠梗阻和慢性肠梗阻长时间不缓解有肠坏死风险等情况，但是手术操作本身会造成腹腔内组织粘连，诱发肠梗阻，反复手术治疗会加重肠梗阻的复杂程度，使得治疗愈发困难，所以非紧急所需，不行手术治疗，保守治疗是本病的第一选择。保守治疗主要有禁食水、胃肠减压、抗感染、补液、肠外营养支持等，以逐步恢复肠道功能。本病发病率和复发率高，给患者家庭、社会经济带来了极大负担。当前肠梗阻的中医治疗主要有针灸、中药内服、中药穴位贴敷、中药保留灌肠等治疗[2]。大多数研究和临床应用中，中医治疗肠梗阻主要取“六腑以通为用”之义，组方大多以大承气汤为底方[3-4]，峻下通腑以缓解肠道梗阻，疗效显著。大承气汤是张仲景《伤寒杂病论》经典方剂，用于阳明腑实证[5]。全方大黄泻热通便,荡涤肠胃,为君药。芒硝助大黄泻热通便,并能软坚润燥,为臣药,二药相须为用,峻下热结之力甚强;积滞内阻,则腑气不通,故以厚朴、枳实行气散结,消痞除满,并助硝、黄推荡积滞以加速热结之排泄,共为佐使。本方在经方大承气汤的基础之上加用了延胡索和赤芍，延胡索-赤芍为临床上经典的药物使用组合，二者相使为用，能够显著的活血化瘀，理气止痛。在既往的文献研究中，延胡索-赤芍也是大承气汤诸多加味药物中较为经典的药对[6]。大承气汤通里攻下，延胡索-赤芍药对活血化瘀，诸药合用，共筑活血通里，攻下通腑之功。故笔者基于网络药理学从成分-靶点-通路预测加味大承气汤活血攻下法治疗肠梗阻的作用机制。

1 材料与方法

1.1 复方化学成分收集及药物靶点预测 将加味大承气汤药物名称（大黄、枳实、厚朴、延胡索、赤芍）在中药系统药理学数据库Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database[7](TCMSPTM，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)Herb Name中输入。根据药物口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30% 、类药性指数（Drug Likeness，DL）≥0.18[8]筛选有效化学成分。药物靶点数据来源于Drugbank[9](https://www.drugbank.ca/)、Uniprot(https://www.Uniprot. org/)数据库。因TCMSP数据库尚未收录矿石类药物，芒硝的化学成分及相关药物靶点查找自TCMID及BATMAN数据库。

1.2 疾病靶点来源 基于GeneCards(https://www.genecards.org/)与OMIM-NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)数据库筛选疾病靶点。

1.3 复方-疾病交集基因的获取 应用R软件中的Draw Venn Diagrams工具对1.2、1.3和1.4中获取到的药物靶点与疾病靶点进行处理，获得交集基因靶点。

1.4 成分-靶点网络图的构建 将复方成分，交集基因靶点导入Cytoscape3.7.1，构建成分-靶点网络图。

1.6 加味大承气汤治疗肠梗阻的靶蛋白相互作用（Protein Protein interaction， PPI）网络构建 应用Cytoscape 3.7.1中Bisogenet插件进行PPI蛋白网络互作分析，使用CytoNCA进行网络拓扑分析。

1.6 GO和KEGG通路富集分析 基于GO数据库（Gene Ontology，http://geneontology.org） 与KEGG通路数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp） 对 交 集 基因，细胞成分，分子功能，生物学过程及其发生作用的信号通路进行富集分析，得出加味大承气汤治疗肠梗阻的核心靶标，将结果按P值大小进行降序排列；取前20的KEGG信号通路，应用Cytoscape3.7.1构建核心靶标-关键通路网络。

2 结果

2.1 复方化学成分及药物靶点 本次研究共收集加味大承气汤药物化学成分121个，预测靶点1478个，通过UniProt数据库对药物靶基因进行校正。加味大承气汤各中药化学成分及预测靶点数量见表1，各中药有效成分见表2。

表1 加味大承气汤中药-成分-靶点信息

表2 加味大承气汤的有效成分

Mol ID Molecule Name OB（%） DL 来源Mol001460 Cryptopin 78.74 0.72 延胡索Mol001461 Dihydrochelerythrine 32.73 0.81 延胡索Mol001463 Dihydrosanguinarine 59.31 0.86 延胡索Mol001474 Sanguinarine 37.81 0.86 延胡索Mol000217 (S)-Scoulerine 32.28 0.54 延胡索Mol002670 Cavidine 35.64 0.81 延胡索Mol002903 (R)-Canadine 55.37 0.77 延胡索Mol000359 Sitosterol 36.91 0.75 延胡索Mol004071 Hyndarin 73.94 0.64 延胡索Mol004190 (-)-alpha-N-methylcanadine 45.06 0.8 延胡索Mol004191 Capaurine 62.91 0.69 延胡索Mol004193 Clarkeanidine 86.65 0.54 延胡索Mol004195 CORYDALINE 65.84 0.68 延胡索Mol004196 Corydalmine 52.5 0.59 延胡索Mol004197 Corydine 37.16 0.55 延胡索Mol004198 18797-79-0 46.06 0.85 延胡索Mol004199 Corynoloxine 38.12 0.6 延胡索Mol004200 Methyl-[2-(3,4,6,7-tetramethoxy-1-phenanthryl)ethyl]amine 61.15 0.44 延胡索Mol004202 Dehydrocavidine 38.99 0.81 延胡索Mol004203 Dehydrocorybulbine 46.97 0.63 延胡索Mol004204 Dehydrocorydaline 41.98 0.68 延胡索Mol004205 Dehydrocorydalmine 43.9 0.59 延胡索Mol004208 Demethylcorydalmatine 38.99 0.54 延胡索Mol004209 13-methyldehydrocorydalmine 35.94 0.63 延胡索Mol004210(1S,8'R)-6,7-dimethoxy-2-methylspiro[3,4-dihydroisoquinoline-1,7'-6,8-dihydrocyclopenta[g][1,3]benzodioxole]-8'-ol 43.95 0.72 延胡索Mol004763 Izoteolin 39.53 0.51 延胡索Mol004214 Isocorybulbine 40.18 0.66 延胡索Mol004215 Leonticine 45.79 0.26 延胡索Mol004216 13-methylpalmatrubine 40.97 0.63 延胡索Mol004220 N-methyllaurotetanine 41.62 0.56 延胡索Mol004221 Norglaucing 30.35 0.56 延胡索Mol004224 Pontevedrine 30.28 0.71 延胡索Mol004225 Pseudocoptisine 38.97 0.86 延胡索Mol004226 24240-05-9 53.75 0.83 延胡索Mol004228 Saulatine 42.74 0.79 延胡索Mol004230 Stylopine 48.25 0.85 延胡索Mol004231 Tetrahydrocorysamine 34.17 0.86 延胡索Mol004232 Tetrahydroprotopapaverine 57.28 0.33 延胡索Mol004233 ST057701 31.87 0.56 延胡索Mol004234 2,3,9,10-tetramethoxy-13-methyl-5,6-dihydroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-8-one 76.77 0.73 延胡索Mol000449 Stigmasterol 43.83 0.76 延胡索Mol000785 Palmatine 64.6 0.65 延胡索

Mol ID Molecule Name OB（%） DL 来源Mol000787 Fumarine 59.26 0.83 延胡索Mol000790 Isocorypalmine 35.77 0.59 延胡索Mol000791 Bicuculline 69.67 0.88 延胡索Mol000793 C09367 47.54 0.69 延胡索Mol000098 Quercetin 46.43 0.28 延胡索Mol001002 Ellagic acid 43.06 0.43 赤芍Mol001918 Paeoni fl orgenone 87.59 0.37 赤芍Mol001921 Lacti fl orin 49.12 0.8 赤芍Mol001924 Paeoni fl orin 53.87 0.79 赤芍Mol001925 Paeoni fl orin_qt 68.18 0.4 赤芍Mol002714 Baicalein 33.52 0.21 赤芍Mol002776 Baicalin 40.12 0.75 赤芍Mol000358 Beta-sitosterol 36.91 0.75 赤芍Mol000359 Sitosterol 36.91 0.75 赤芍Mol004355 Spinasterol 42.98 0.76 赤芍Mol000449 Stigmasterol 43.83 0.76 赤芍Mol000492 (+)-catechin 54.83 0.24 赤芍Mol006990 (1S,2S,4R)-trans-2-hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyranoside 30.25 0.27 赤芍Mol006992 (2R,3R)-4-methoxyl-distylin 59.98 0.3 赤芍Mol006994 1-o-beta-d-glucopyranosyl-8-obenzoylpaeonisuffrone_qt 36.01 0.3 赤芍Mol006996 1-o-beta-d-glucopyranosylpaeonisuffrone_qt 65.08 0.35 赤芍Mol006999 Stigmast-7-en-3-ol 37.42 0.75 赤芍Mol007003 Benzoyl paeoni fl orin 31.14 0.54 赤芍Mol007004 Albi fl orin 30.25 0.77 赤芍Mol007005 Albi fl orin_qt 48.7 0.33 赤芍Mol007008 4-ethyl-paeoni fl orin_qt 56.87 0.44 赤芍Mol007012 4-o-methyl-paeoni fl orin_qt 56.7 0.43 赤芍Mol007014 8-debenzoylpaeonidanin 31.74 0.45 赤芍Mol007016 Paeoni fl origenone 65.33 0.37 赤芍Mol007018 9-ethyl-neo-paeonia fl orin A_qt 64.42 0.3 赤芍Mol007022 EvofolinB 64.74 0.22 赤芍Mol007025 Isobenzoylpaeoni fl orin 31.14 0.54 赤芍Mol002883 Ethyl oleate (NF) 32.4 0.19 赤芍Mol005043 Campest-5-en-3beta-ol 37.58 0.71 赤芍

2.2 疾病靶点的获取 在GeneCards与OMIMNCBI数据库中以“Intestinal obstruction、Obstacle”为关键词进行检索，为确保疾病靶点的真实有效性，GeneCards数据库按照Relevance score≥25筛选，将2个数据库中所得的疾病靶点汇总并删除重复，通过UniProt数据库对疾病靶基因进行校正，共获得147个，将其作为复方的候选靶标来源。

2.3 获取复方-疾病交集基因 将1.1与1.2中获得的复方药物靶点与疾病靶点数据导入到R软件，应用Draw Venn Diagrams工具获取交集基因，见表3；并绘制韦恩图，见图1。

表3 加味大承气汤治疗肠梗阻的24个靶蛋白

图1 复方-疾病交集基因韦恩图

2.3.2 构建成分-靶点网络图 将加味大承气汤复方成分，复方-疾病交集基因靶点导入Cytoscape3.7.1中，应用Network Analyze插件构建复方化学成分-靶点作用网络，见图2。核心靶标显示为方形，活性化学成分显示为椭圆形，不同药物显示为不同颜色，其中多个药物共有的化学成分显示为红色，大黄显示为深蓝色，枳实显示为紫色，厚朴显示为草绿色，延胡索显示为天蓝色，赤芍显示为湖蓝色，生姜所含有效成分被共有化学成分所覆盖。从图2可知，一个化学成分往往与多个交集基因靶点对应，且一个交集基因与靶点也同时对应多个化学成分，化学成分又从属于不同的中药，这说明加味大承气汤治疗肠梗阻是通过多成分、多靶点起效的。

2.4 交集基因PPI网络构建与分析 交集基因蛋白相互作用网络的构建主要借助于Cytoscape3.7.1中Bisogenet插件，插件是由6个相互作用的蛋白数据库构成，包括Database of Interacting Proteins、Biological General Repository for Interaction Datasets、Human Proteins Reference Database、Intact Molecular Interaction Database、Molecular Interaction Database、Biomolecular Interaction Network Database。将交集基因导入到Bisogenet插件中，初步构建蛋白作用网络，见图3，通过观察网络发现交集基因与2425个靶点产生直接或间接的联系；进一步应用Cytoscape3.7.1中CytoNCA插件对所得的PPI作用网络进行进一步拓扑分析，筛选网络中的关键节点。按DC（Degree）＞61筛选出264个节点，对所得的298个节点进一步进行拓扑分析，按BC（Betweenness）＞600筛选出16个关键节点，筛选方法见图4，其中EGFR（表皮生长因子受体），MYC（MYC原癌基因，BHLH转录因子）在网络中连接程度较高。

图2 复方化学成分-靶点作用网络

图3 PPI网络

图4 关键节点的筛选流程

2.5 交集基因的GO和KEGG通路富集分析 基于GO数据库和KEGG通路数据库对交集基因进行富集分析，富集条件为P值Cutoff=0.05且q值Cutoff=0.05，其余默认原始设置，选取排名前20的项目，见表4、表5，并根据每个项目的P值、q值及富集在其上的基因数目绘制图形，见图5、图6，横坐标表示靶点数，左边表示生物学过程，颜色表示P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色。GO分析发现交集基因主要参与了对营养水平的反应、平滑肌细胞增殖的调控、平滑肌细胞增殖等生物学过程。KEGG通路富集发现主要涉及PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路以及HIF-1信号通路等。应用Cytoscape3.7.1对富集到的交集基因作用通路做可视化处理，构建交集基因靶点-通路网络，见图7，按Degree值大小决定节点大小。从图可知，一条KEGG通路可以调控多个靶点基因，一个靶点基因同时出现在多条通路中，这说明加味大承气汤治疗肠梗阻是通过多靶点、多通路的。

图5 交集基因GO分析图

表4 交集基因相关的GO富集条目

序号 ID 名称 P值 Q值 Count 10 GO:0035296 regulation of tube diameter 4.14E-10 2.45E-08 7 11 GO:0050880 regulation of blood vessel size 4.14E-10 2.45E-08 7 12 GO:0097746 regulation of blood vessel diameter 4.14E-10 2.45E-08 7 13 GO:0035150 regulation of tube size 4.35E-10 2.45E-08 7 14 GO:0062013 positive regulation of small molecule metabolic process 6.66E-10 3.20E-08 7 15 GO:1905952 regulation of lipid localization 7.98E-10 3.58E-08 7 16 GO:0050679 positive regulation of epithelial cell proliferation 5.31E-09 1.88E-07 7 17 GO:0009612 response to mechanical stimulus 6.06E-09 2.04E-07 7 18 GO:0150076 neuroinflammatory response 4.36E-10 2.45E-08 6 19 GO:2000379 positive regulation of reactive oxygen species metabolic process 2.85E-09 1.07E-07 6 20 GO:0150077 regulation of neuroinflammatory response 1.64E-09 6.88E-08 5

表5 交集基因相关的KEGG富集通路

图6 交集基因KEGG通路富集图

图7 交集基因靶点-通路图

3 讨论

根据中医理论，机械性肠梗阻属于“肠结病”的范畴。《素问·灵兰秘典论》曰：“大肠者，传导之官，变化出焉。小肠者，受盛之官，化物出焉”。肠梗阻发生之后，肠道“传化物而不藏，实而不满”状态异常，局部气血津液输布异常，不通则痛，进而肠管失养而糜废不用，影响其“泌别清浊、传化糟粕”的功能。大承气汤是《伤寒杂病论》的经典方，现代临床将此方广泛用于肠梗阻、胰腺炎等阳明腑实证。

本研究基于网络药理学的方法研究加味大承气汤治疗肠梗阻的作用机制。根据OB和DL参数，共筛选出加味大承气汤化学成分121个，预测靶点1478个。结果表明，槲皮素，木犀草素、β-谷甾醇等是其主要的化学成分。药理学研究表明，槲皮素是一种黄酮类化合物，能够有效抑制肿瘤坏死因子和白细胞介素等炎症因子的表达，且具有舒张血管的作用，能够清除氧自由基，从而达到具有抗炎，抗氧化，消炎镇痛的作用[10-12]。木犀草素是一种天然黄酮类物质，具有较强的抗炎作用。木犀草素能抑制IL-6、IL-1B、TNF-α等炎症因子的表达，并且能够提高IL-10（抗炎细胞因子）的水平来调控炎症反应[13]。刘威良等[14]发现β-谷甾醇通过调节下丘脑-垂体-肾上腺激素系统达到类似激素样抗炎的作用。肖志彬等[15]发现β-谷甾醇可以增强血清中氧自由基清除能力，降低肿瘤坏死因子水平达到抗炎的作用。槲皮素主要来源于延胡索，延胡索，性辛苦温，能活血行气止痛，广泛用于各种瘀阻疼痛。木犀草素主要来源于枳实，枳实能破气消积，化痰散痞。β-谷甾醇主要来源于大黄、赤芍，大黄能泻下攻积，凉血祛瘀。赤芍能凉血散瘀止痛。肠梗阻发病时，肠道局部发生炎症反应，并且有肠黏膜淤血水肿等一系列病理过程，在加味大承气汤中药物所含的木犀草素、β-谷甾能有效介导炎症反应达到抗炎的目的。而肠道黏膜所发生的的一系列病理变化及疼痛的临床症状也与中医理论上“瘀”以及“不通则痛”的理论相契合，应用延胡索-赤芍活血化瘀止痛药对则能够有效缓解肠道局部淤血的表现，肠道黏膜淤血、水肿减轻又能够促进肠蠕动，缓解肠梗阻的症状，这也是延胡索-赤芍成为临床上广泛应用于大承气汤加味的中药的重要原因。获取药物疾病的交集基因是时并未获取到芒硝的相关靶点，我们推测芒硝治疗肠梗阻所起到的泻下通便软件润燥的功效是通过物理作用起效。芒硝的主要成分是含水硫酸钠（Na2SO4·10H2O），其原理是在到达肠道局部时机械刺激肠壁，在肠内形成高渗溶液，促进肠蠕动引起泻下。这也是加味大承气汤能够攻下软坚的重要原因。

在化学成分-交集基因靶点网络中，PTGS2（前列腺素G/H合成酶2），ADRB2（肾上腺素受体β2），PRSS1（丝氨酸蛋白酶1）Degree值较高。在加味大承气汤的主要化学成分中，槲皮素，木犀草素、β-谷甾醇等主要化学成分能够作用于网络中的多个交集基因靶点，而PTGS2、ADRB2、PRSS1等主要靶点也与多个化学成分互相作用，这这说明加味大承气汤可能是通过多味中药中的槲皮素，木犀草素、β-谷甾醇等主要化学成分作用于PTGS2、ADRB2、PRSS1等主要靶点来达到治疗肠梗阻的目的。

为进一步阐述靶点之间的作用关系，对复方-疾病交集基因靶点进行蛋白互作分析。通过分析发现，EGFR（表皮生长因子受体）在网络中Degree值较大，在网络中连接程度较高。进一步对交集基因进行GO功能富集分析，发现交集基因主要参与了对营养水平的反应、平滑肌细胞增殖的调控、平滑肌细胞增殖等生物学过程。EGFR通路能够有效促进有丝分裂，形成角质细胞，角质细胞也可通过EGFR刺激再生。EGF是EGFR主要配体之一，能够刺激周围神经修复和再生[16]。另外，Marino等[17]对人表皮淋巴管内皮细胞（LECs）进行体外研究，发现 EGFR可以通过表达 EGF 来促进淋巴管形成。EGFR能够使receptor ligand activity（受体配体活性）增强，来促进血管淋巴管的再生，刺激周围神经的修复和再生来达到抑制炎症反应，减轻疼痛，缓解肠梗阻症状的目的。平滑肌细胞能够促进肠道蠕动，帮助消化和排空食物。肠梗阻往往伴随着痛、胀、呕、闭的症状，患者营养状态较差。GO富集到的对营养水平的反应、平滑肌细胞增殖、调控等生物学过程可能是加味大承气汤治疗肠梗阻的关键所在。

交集基因KEGG通路富集分析，其通路主要包括PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路以及HIF-1信号通路等。PI3K-Akt是存在于机体细胞的重要信号通路，参与机体多种生理病理过程[18]，对细胞的生长、增殖起中心调控作用[19]。PI3K-Akt信号通路能够降低机体炎症因子的表达，介导炎症反应。JAK-STAT信号通路能调控诸多细胞因子（白细胞介素、干扰素、红细胞生成素）、免疫信号传导[20]，与人体内诸多疾病有着密切的联系[21]。HIF-1是介导机体对缺氧环境适应性反应的关键转录激活因子，能够随着细胞中氧浓度的变化而改变基因表达[22]。肠梗阻的诊疗过程中会引起机体微环境的变化，造成机体局部缺氧，而加味大承气汤能够使得机体HIF-1信号通路激活，从而改善机体微环境。因此，加味大承气汤可能是通过激活机体的PI3K-Akt信号通路、JAKSTAT信号通路以及HIF-1信号通路来达到治疗肠梗阻的作用。

上述KEGG通路的富集结果还显示，还富集到了膀胱癌，肿瘤蛋白多糖，人巨细胞病毒感染等通路结果，这说明加味大柴胡汤除了直接作用于PI3K-Akt、JAK-STAT、HIF-1信号通路，还具有影响机体内多种多种代谢通路的基因靶点发挥治疗肠梗阻的作用。

本研究仍存在不足，由于TCMSP数据库中没有芒硝这味药，未能系统整体的展现加味大承气汤治疗肠梗阻的作用机制。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法，分析加味大承气汤活血攻下法治疗肠梗阻的机制。结果显示，主要是通过槲皮素，木犀草素、β-谷甾醇等多种潜在化学成分作用于EGFR等基因，从而调节多种生物学功能以及多条通路来达到治疗目的。为后续进一步探讨机制和优化实验设计提供支持，同时，本文也为中药及其复方治疗某种疾病的机制分析提供了研究方法。