脱钙率对同种异体骨理化性能的影响*

陈书香 张梅 杨洁 孙雪莲 胡荣荣 史丰田*

关节软骨属于透明软骨，是特殊的结缔组织，主要由蛋白多糖凝胶及Ⅱ型胶原构成[1]。它在关节部位起着缓冲应力、吸收震荡、润滑关节表面、防止磨损的重要作用。关节软骨是无血管组织，没有血液供应，营养来源于周围关节滑液的滋润，一旦损伤就很难再生，故软骨修复成为骨科医生最具挑战性的临床难题之一[2]。

同种异体骨无论是形态学还是力学特征都具有合成材料无可比拟的优势。但由于其硬度大，植入软骨处会对正常软骨造成磨损，故不适于软骨缺损的修复。脱钙骨基质具有和同种异体骨最接近的三维结构[3]，主要成分为Ⅰ型胶原，适于细胞黏附和生长。脱钙处理可以让同种异体骨富有弹性、柔韧性，但脱钙过度会使其力学性能变差，甚至破坏其三维结构。脱钙骨基质作为一种天然的支架材料，已有很多文献报道其生物相容性[4-6]，但是对其理化性能的研究较少，因此本文主要研究脱钙率对支架物理性能的影响，为优选软骨组织工程支架材料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

同种骨植入材料（型号:皮松质骨块，上海亚鹏生物技术有限公司），该产品已经过脱脂、脱细胞、病毒灭活、去除免疫原、清洗、辐照灭菌等处理，尽量选用皮质骨与松质骨厚度差别不大的样品;依地酸二钠（南京化学试剂股份有限公司）;PBS缓冲溶液（pH=7.2，自制）；原子吸收分光光度计（TAS-990，北京市普析通用仪器有限责任公司）;单筒视频显微镜（LHZ-45，重庆留辉科技有限公司）;智能孔隙率、吸水率分析仪[MAY-Entris120，秒准科技（深圳）有限公司]；万能力学试验机[CMT6104，美特斯工业系统（中国）有限公司]。

1.2 实验方法

1.2.1 脱钙液制备选用依地酸二钠作为脱钙剂，1 LPBS缓冲溶液（pH=7.2）中加入100 g依地酸二钠，待完全溶解后，放置备用。

1.2.2 脱钙处理

将骨块浸泡于脱钙液中。每天更换脱钙液，检测换下的脱钙液中的钙离子浓度，由脱钙液中的钙离子含量以及同种异体骨钙含量，推算脱钙率，待脱钙率达到30%、50%、70%、80%、99.9%时取出骨块，检测产品的孔径、孔隙率、吸水率、力学性能、降解率。

1.3 检测方法

1.3.1 同种异体骨钙含量检测

取1 g同种异体骨按照GB/T 14233.1—2008中7.3.1.1湿消解法制备检测液，用原子吸收分光光度计检测钙离子含量，所用火焰为空气—乙炔焰。配制一系列已知浓度的钙标准溶液，以去离子水做空白对照，依次测定标准溶液的吸光度，以标准溶液浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。试样经过适当处理后，在完全相同条件下测定吸光度，通过标准工作曲线换算出被测溶液钙离子浓度。仪器参数如下:波长422.7 nm;光谱带宽0.4 nm;推荐灯电流3.0 mA，负高压295 V;燃烧头高度10 mm;积分时间3 s;空气压力及流量分别为0.25 MPa，5 500 mL/min;乙炔压力及流量分别为0.10 MPa，5 000 mL/min。

1.3.2 脱钙液钙含量检测

取换下的脱钙液，稀释至合适的倍数，使浓度落在标准曲线内，用原子吸收分光光度计检测钙离子浓度。

1.3.3 孔径取待测的骨块，用手术刀切成薄片，放于显微镜下检测完整孔径尺寸。每个观察界面测量6次，取平均值。

1.3.4 孔隙率、吸水率

取待测的骨块，用智能孔隙率、吸水率分析仪检测，记录结果。

1.3.5 弹性模量

取待测骨块，修剪成10 mm×10 mm×10 mm的小块，充分浸泡后，擦去表面水分，放于检测台上;用50 N压力探头进行压缩实验，压缩速率为1 mm/min，应变量达到50%时停止实验，获取应力—应变曲线，依据该曲线的直线区计算弹性模量。

1.3.6 降解率

取6块产品称重后分别置于试管中，加适量人工降解液（0.1 mol/L PBS），置于37℃烘箱中降解。分别于2、4、6、8、10和12周取样，室温干燥，测质量，取平均值并计算质量损失率。换等量生理降解液继续降解。计算出骨块在各个时间段（每个时间段为2周）的降解率并绘制出降解率曲线，见公式（1）。

降解率P（%）=[（A0-A1）/A0]×100 （1）P:降解率;A0:降解前一个时间点的质量平均值;A1:降解后一个时间点的质量平均值。

2 结果

2.1 钙含量

由实验可知，通常人骨钙含量在26%左右[7]。随着脱钙液的持续更换，骨块的钙含量逐渐降低，通过脱钙液中钙含量计算的脱钙率与骨块实际钙含量具有较高的一致性。随着钙离子的流失，骨块的孔径明显增大，相应压缩模量迅速降低，相关数据见表1。

2.2 孔径

未脱钙的同种异体骨很硬，显微镜下观察其骨片透明度差、质白，松质骨部分具有粗糙、疏松多孔结构，孔径大小不等，形状不规则，孔隙直径为200～400 m，平均为353 m（见图1、表1）。随着脱钙率的增大，骨块透明度增加，脱钙率为50%时即成明显的透明状，平均孔径614 m。脱钙率为70%～99.9%的脱钙骨基质呈海绵状，富有弹性和一定的韧度，平均孔径为650～1 000 m。

图1 不同脱钙率下的显微镜图

表1 不同脱钙率下的钙含量、孔径、压缩模量

2.3 孔隙率、吸水率

由表1可知，随着脱钙率的增加，同种异体骨块的孔隙率和吸水率均明显增大，分别由未脱钙时的40.39%和61.28%增加到脱钙率为99.9%时的85.23%和610.74%。脱钙率为70%之前，孔隙率的增长较为迅速，此后趋缓。吸水率的变化趋势则相反。

2.4 压缩模量

对未脱钙原材料的力学分析表明，其抗压力可达450 N以上，压缩模量大，可达5.70 MPa，在压缩过程中发生多次脆性断裂（见图2）。随着脱钙率的增加，样品的压缩模量迅速下降，抗压力降至不足5 N，并且不再发生脆性断裂。脱钙率80%以上的脱钙骨弹性极好，压缩后可快速恢复。脱钙率99.9%的骨块已不再表现出能够承受特定压力的能力。不同脱钙率下同种异体骨块的压缩模量见表1。

图2 不同脱钙率下同种异体骨的应力—应变图

2.5 降解率

随着降解时间的延长，无论脱钙程度如何，同种异体骨块均发生明显的降解反应，且脱钙率越高，降解速度越快。前4周降解速率较慢，此后逐渐加速，6周后降解速度明显加快，当到12周时99.9%脱钙率的骨基质迅速裂解，降解率达85%以上（见图3）。

图3 不同脱钙率下的降解率

3 讨论

同种异体骨作为一种自然生物支架材料，因其特有的结构和富含多种生物活性因子，对软骨组织缺损部位起到支撑和保护作用的同时可诱导缺损组织再生，故被广泛应用于关节软骨损伤再生修复的研究中[8]。

由于新鲜同种异体骨材料较难获取，本研究选用市售产品为原材料，并在实验时作进一步挑选，最大程度保证批次的均一性。所用同种异体骨由皮质骨、松质骨两部分组成，在植入关节软骨缺损部位时，松质骨在内，皮质骨在外。未脱钙的同种异体骨虽富含胶原，但质地坚硬，与质软、滑润的关节软骨组织不相匹配，因此必须对其作脱钙处理。一方面，脱钙可以解除同种异体骨中致密的矿物成分对骨形成蛋白（BMP）的包绕，使BMP能够顺利释放，进而与相关生长因子协同作用，发挥诱导成骨潜能[9]。但脱钙必须适度，因为适当含量钙离子的存在，可作为新生骨再钙化的核心，为磷酸钙的沉积提供晶核[10]。另一方面，脱钙使同种异体骨中的胶原成分得以保留，同种异体骨块的强度降低、韧性增加，从而与关节软骨的匹配性增加。

此外，脱钙导致同种异体骨的一系列物理性能发生了明显改变，如孔径、吸水率增加，压缩模量下降等。骨组织工程支架材料的孔径和孔隙率是三维多孔材料的两个主要评价指标[11]，孔径影响成骨能力的主要原因是不同大小的孔径在促进成骨细胞沉积及黏附方面的能力不同，并且不同大小的孔径材料的降解速度不同，从而影响新骨的形成和长入[12]。

由于脱钙对皮质骨孔径的影响较小，且松质骨才是与软骨下骨的接触部位，故本研究重点关注松质骨部分的性能变化。由表1可知，随着脱钙率的增大，骨块的平均孔径、孔隙率、吸水率均显著增加。脱钙率为50%时孔径即可达600 m以上，原因是在脱钙过程中，由于骨中的钙元素不断地被脱离下来，使骨小梁中的胶原膨胀拉伸而导致孔径增大，这种结构特征可提供宽大的空间，容纳更大量的种子细胞，有利于细胞黏附、增殖，细胞外基质沉淀，营养的进入以及代谢产物的排出[13]。同样，随着骨中钙成分的流失，同种异体骨块的表观密度会变小，而孔隙率增大，脱钙率达到70%以后，孔隙率增长速度放缓，表明脱钙并未明显改变骨块的三维多孔结构，有利于此骨块作为支架材料使用。相较而言，脱钙率对吸水率的影响更为显著，其主要原因是来自于钙的流失[14]。

关节软骨是关节部位的主要负重组织，表面软骨能够承受的局部压力为0.8～2 MPa[15]，以成人髋关节为例，站立时软骨接触面的静态压力约为0.1 MPa，行走时增加到4 MPa，跳跃时可达10 MPa[16]。同时要具有一定的弹性，以满足关节活动时应力传导的需要[17]。

当同种异体骨的钙含量较高时，骨硬而脆，进行压缩模量检测时发现，压缩模量大、压缩时易压碎。随着脱钙率的增加，骨块韧性逐渐增加、压缩模量下降。脱钙率大于80%时，同种异体骨干燥时质地仍较硬，水溶液浸泡后，质地柔软，松质骨部分类似海绵，压缩初始形变大，并可承受一定的压力（约4.2 N），且形变在压力去除后可快速恢复。质地柔软的同种异体骨方便植入人体，并能有效减少对正常软骨的磨损，故非常适合于关节软骨损伤的修复。

骨组织工程支架的降解速度主要由材料本身性质和植入后局部的生理环境决定。在体内的降解主要与破骨细胞、多核巨细胞的作用有关，同时也与局部的血运供应有关。新骨形成过程中，破骨细胞释放出溶酶体酶等成分，分解支架材料，巨噬细胞则吞噬残存碎片，从而使支架材料逐渐被降解、吸收。

前述已表明，脱钙对同种异体骨材料本身性质造成显著改变，从而明显改变了骨块的降解性能。无论钙含量如何，前4周降解速率较慢，此后逐渐加速，6周后降解速度明显加快，表明材料本身的三维结构在6周后被明显破坏，10周时，80%脱钙率的同种异体骨块已降解近40%，10周时降解近80%，若在体内有酶类物质和细胞组织代谢物的作用的话，其降解速率势必更快。而有研究表明软骨形成需要6～8周[12]。因此，选择合适的脱钙率以保证恰当的降解速率，并与软骨形成保持同步非常重要。

综上所述，以同时包含皮质骨和松质骨的同种异体骨块为原料，对不同脱钙率下骨块的理化性能进行研究。结果表明，随着脱钙率的增加，骨块的孔径、孔隙率、吸水率、降解率均明显增加，钙的流失使同种异体骨的强度降低、韧性增加，与关节软骨的匹配性增强。研究结果表明，在80%脱钙率条件下，同种异体骨块的性能最优，在保证拥有合适的孔径、孔隙率的前提下，还具有一定的机械强度，其降解速率与成骨速率也相当，是一种非常有前景的软骨修复支架材料。