酒泉市狐狸消化道蛔虫分子鉴定及cox1基因序列分析

张建明

(酒泉职业技术学院，酒泉，735000)

生活水平提高使得消费者对裘皮的需求量逐渐增大，狐狸皮毛因其绒毛细柔、保暖性好而备受消费者青睐，且狐狸肉风味独特，药用与食用价值高，使得我国狐狸养殖业发展较为迅速，同时相关产业给养殖户带来了丰厚的利润。由于部分养殖户对狐狸生活习性不熟悉，且饲养环境较差，导致狐狸在养殖过程中容易感染寄生虫病，寄生虫病为消耗性疾病，可影响狐狸的肉质和毛皮质量，继而造成巨大的经济损失[1]。狐狸肠道寄生虫病较为常见，王安等[2]对在呼伦贝尔草原野生狐狸肠道内分离到犬复殖孔绦虫(Dipylidiumcaninum)、多头带绦虫(Taeniamulticeps)、犬钩口线虫(Ancylostomaduodenale)、狮弓蛔虫(Toxascarisleonina)等多达12种肠道蠕虫。犬肠道蛔虫可分为犬弓首蛔虫(Toxascariscanis)和狮弓蛔虫，其终末宿主均为犬、猫和狐狸等动物，其中狮弓蛔虫生活史较为简单，犬摄入感染性卵囊后，幼虫可在犬肠道发育为成虫，导致宿主消瘦、消化不良、毛皮质量下降等，严重导致死亡，同时对公共健康造成巨大威胁[3-4]。对于狮弓蛔虫相关报道主要见于犬、猫等常见犬科(Canidae)动物，但对狐狸源狮弓蛔虫的报道较少。本研究从酒泉市某北极狐(Alopexlagopus)养殖场狐狸肠道内分离到6条蛔虫，通过对虫卵及成虫的形态学和分子生物学技术对虫株进行鉴定，最终确定为狮弓蛔虫病感染，本次研究为狐狸狮弓蛔虫病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源与主要试剂

6个蛔虫分离株分离于酒泉市某北极狐养殖场自然死亡的狐狸小肠内(3只)，根据蛔虫分离株的形态特征可初步鉴定为蛔虫，将其分别命名为JQ01—JQ06。将虫株分别保存于70%酒精中，用于形态学和分子鉴定。DNA提取试剂盒 Promega公司；蛋白酶K购于Merck公司；PCR相关试剂购于北京天根生化科技有限公司；引物由上海生物工程技术有限公司合成。

1.2 形态学鉴定

形态学鉴定步骤参考文献[5]，将标本放置于光学显微镜进行观察，参考相关文献[6]根据头部和尾部对虫种进行形态学鉴定；采用饱和盐水漂浮法对粪便样品进行处理，显微镜下观察虫卵形态，根据虫卵形态学特征进行初步鉴定[6]。

1.3 虫种DNA提取与cox1基因序列扩增

参考DNA提取试剂盒对虫体基因组进行提取，以基因组DNA为模板，采用文献[7]中引物对虫体线粒体细胞色素I(cox1)基因部分序列进行扩增，其中上游引物(cox1-F)：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′，下游引物(cox1-R)：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAATG-3′PCR体系(50 μL)：PCR easy mix 25 μL、上下游引物(10 pmol)各2 μL、DNA模板3 μL、双蒸水18 μL，混匀后低速离心5 s，同时设置阴性对照和阳性对照，其模板分别为双蒸水和实验室保存的犬狮弓蛔虫DNA样品；扩增条件为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共35个循环；最后72 ℃5 min。PCR产物经过凝胶电泳检测，预期片段大小为420 bp左右。

1.4 cox1基因序列测序与分析

将PCR阳性产物进行纯化后送至上海生物工程技术有限公司双向测序，从GenBank中下载具有代表性蛔虫cox1基因序列，应用DNAstar软件对核苷酸序列同源性进行分析，以MEGA 5.0软件分析序列的碱基比例，同时构建系统种系发育树。

2 结果

2.1 形态学鉴定结果

对虫卵特征进行观察，该虫卵为椭圆形，外有光滑的壳，符合狮弓蛔虫虫卵特征[8]，故也将从病死狐狸肠道分离蛔虫分离株初步判定为狮弓蛔虫(图1)。

图1 狮弓蛔虫虫卵(左图)及成虫分离株(右图)形态学观察Fig.1 Morphological observation of egg(left)and adult isolates(right)of Toxascaris leonina

2.2 cox1基因序列PCR扩增结果

本次研究对6个狐狸源蛔虫分离株的线粒体cox1基因部分序列进行扩增，凝胶电泳图结果如图2所示，6个样品均扩增出约420 bp的条带，与预期大小基本一致，阴性对照无条带。

2.3 蛔虫cox1基因序列分析

测序结果显示，本次研究获得的6个蛔虫cox1基因序列大小一致，为418 bp，其A、T、C、G碱基所占平均比例分别为17.82%、44.50%、11.14%和26.49%，序列表现出明显的AT碱基富集(62.38%)。6个虫株的cox1基因序列同源性为99.4%—100.0%，与已知狮弓蛔虫分离株(KC293944.1、KC293932.1)同源性为99.4%—99.7%，与犬弓首蛔虫(KC2939 03.1、KC293913.1)、狸猫弓蛔虫(Toxocaratanuki)(AB446546.1)、猪蛔虫(Ascarissuum)(AB591805.1)和人蛔虫(Ascarislumbricoides)(AB591798.1)相应基因序列同源性为86.2%—91.9%。序列同源性分析结果表明6个狐狸源蛔虫分离株与狮弓蛔虫同源性最高(图3)，将其基因序列提交至GenBank收录，其序列号为(MK591006.1-MK591011.1)。

图2 狐狸源蛔虫线粒体cox1基因序列扩增凝胶电泳图Fig.2 Analysis of amplification of mitochondrial cox1 gene sequences from foxy roundworm 注：M：DL2000 marker；P：阳性对照；N：阴性对照；1—6：检测样品 Note：M，DL2000 marker.P，positive sample.N，negative sample.1-6，six tested specimens

图3 狐狸源蛔虫与其他蛔虫cox1基因序列同源性比较结果Fig.3 Analysis of homology comparison of cox1 gene sequences of Ascaris from foxes and other animals

2.4 cox1基因序列系统进化分析

为了进一步分析本研究获得的6株狐狸源蛔虫分离株与其他已知蛔虫的种系发育关系，以狸猫弓蛔虫(AB446546.1)为外群，应用MEGA 5.0软件中NJ法构建系统种系发育树。结果如图4所示，6个蛔虫分离株与已知不同宿主源狮弓蛔虫(KC293944.1、AJ920064.1、MH795159.1和KC293932.1)所属分支聚为同一支，与猪蛔虫(AB591805.1)和人蛔虫(AB591798.1)相距较近，与犬弓首蛔虫所属分支相距较远。结合形态学鉴定结果，可将本次研究获得的6个狐狸源蛔虫鉴定为狮弓蛔虫。

图4 基于cox1基因序列构建狐狸源蛔虫与其他蛔虫的种系发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on the cox1 gene sequences of Ascaris from foxes and other animals

3 讨论

蛔虫病是常见的寄生虫病，主要寄生于宿主小肠内，导致宿主生长缓慢、免疫力下降、肠道堵塞等，常继发其他感染性疾病，甚至导致宿主死亡[9-10]。狮弓蛔虫属于蛔目(Ascaridida)，蛔科(Ascarididae)，弓蛔属，可感染犬科、猫科(Felidae)等多种哺乳动物，掠夺宿主营养物质，引发胃肠炎、肠道堵塞等临床症状，同时感染狮弓蛔虫的宿主可随粪便排出感染性虫卵，感染性虫卵污染水源、饲料或土壤后，其他宿主接触或吞食含感染性虫卵的土壤或食物可感染该病。

由于寄生虫形态学特征(特别是形态学相近的虫种)易受地理环境的影响，对寄生虫进行形态学鉴定有一定的局限性[11]，以PCR技术为代表的分子生物学技术已经广泛应用于寄生虫的虫种鉴定，其中线粒体cox1基因广泛用于寄生虫的分子鉴定和种系遗传学研究[12-14]。目前，关于狐狸源蛔虫的分子鉴定与遗传变异研究较少。在形态学鉴定的基础上，本次研究通过对狐狸源蛔虫cox1基因进行PCR扩增与分析，结果确定本次研究分离的6株狐狸源蛔虫均为狮弓蛔虫，其结果印证前期研究[2]，序列分析结果显示，狐狸源狮弓蛔虫cox1基因序列较为保守，种内遗传差异为0—0.6%，低于猎豹(Acinonyxjubatus)狮弓蛔虫cox1基因序列种内差异(1.4%—6.8%)[14]，提示在进化过程中，不同种属狮弓蛔虫cox1基因序列变异情况有所差异，同时狐狸源狮弓蛔虫cox1序列与其他蛔虫同源性为8.1%—13.8%，种内遗传差异远低于种间变异，提示cox1序列可作为狐狸源狮弓蛔虫分子鉴定标记，同时提示该养殖场需加强对狐狸的饲养管理水平，定期做好驱虫工作。