3种常用消毒剂对基因VII型新城疫病毒的灭活效果

刘 梅，沈欣悦，李建梅，俞 燕，戴亚斌

(中国农业科学院家禽研究所，江苏 扬州 225125)

消毒是动物疫病综合防控中的一个重要环节，也是扑灭疫病最有效的措施，其目的是消灭环境中的病原体，切断传播途径，阻止疫病传播蔓延。疫苗免疫接种和药物防治方法只能针对特定的疫病，而消毒可以针对所有疫病。在动物养殖过程中，建立健全消毒制度，科学合理地选用消毒剂对饮水、禽舍及其环境进行消毒，可有效降低疫病发生风险。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株感染引起的禽类的一种急性、高度接触性烈性传染病，是严重危害养禽业的重要传染病之一[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为须申报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，且在2012年发布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中列为优先防治的动物疫病。当前我国NDV的优势流行株为基因VII型强毒株，免疫接种与消毒、隔离等措施相结合可有效防控该病发生。前期调研发现，癸甲溴铵溶液、聚维酮碘溶液和戊二醛苯扎溴铵溶液为目前种鸡场常用消毒剂。虽然已有研究者对它们的消毒效果进行了评价[2-8]，然而，除高富红等[8]观察了戊二醛苯扎溴铵溶液对NDV LaSota株的灭活效果外，至今尚未有它们对基因VII型NDV灭活效果的报道。为此，本研究对上述3种消毒剂灭活基因VII型NDV的效果进行了评价，明确了它们的毒性作用、最低有效浓度和工作液的保存期，旨在为种禽场ND防控中的消毒剂选择和使用以及合理的消毒措施制定提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 毒株和鸡胚 基因VII型NDV毒株JSC0804分离自发病鸡群，本实验室鉴定保存[9]。SPF种蛋，购自浙江恒达农业发展有限公司，自行孵化至10日龄。

1.2 消毒剂 癸甲溴铵溶液[兽药字(2014)150343067]、聚维酮碘溶液[兽药字(2012)100011577]和戊二醛苯扎溴铵溶液[兽药字(2014)160032459]3种消毒剂均由江苏某大型主要疫病净化示范种鸡场提供。产品信息见表1。试验时消毒剂均在有效期内。

表1 本研究用的消毒剂信息Table 1 Information of disinfectants used in this study

1.3 病毒液制备 基因VII型NDV JSC0804株种毒用10日龄SPF鸡胚连续传代2次复壮。收集第2代死亡鸡胚尿囊液测定病毒鸡胚半数致死量(ELD50)[10]。测得的病毒ELD50为10-8.32/0.1 mL。据此，本研究采用103倍稀释的病毒尿囊液作为病毒工作液。

1.4 中和剂 癸甲溴铵溶液用中和剂为含30 mL/L吐温80、3 g/L卵磷脂和10 g/L甘氨酸的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2)；聚维酮碘溶液用中和剂为含5 g/L硫代硫酸钠、10 mL/L吐温80和2 g/L卵磷脂的PBS；戊二醛苯扎溴铵溶液用中和剂为含40 mL/L吐温80和5 g/L甘氨酸的PBS。配制的中和剂高压灭菌后备用。

1.5 消毒剂对鸡胚最大安全剂量测定 先用PBS将消毒剂5倍稀释，然后再依次倍比稀释(见表2)。每个稀释度经尿囊腔接种5枚10日龄鸡胚，0.1 mL/胚。鸡胚接种后置37 ℃继续孵育，连续观察144 h，同时设PBS对照组。试验重复3次。依下列公式计算不同稀释度消毒剂接种后的鸡胚死亡率。

鸡胚死亡率(%)=死亡鸡胚数/接种鸡胚数×100%

1.6 消毒剂与中和剂的中和产物对鸡胚的毒性测定 将消毒剂和中和剂按1∶9比例混合均匀后，作用10 min。然后将中和产物用PBS依次倍比稀释(见表3)，每个稀释度经尿囊腔接种5枚10日龄鸡胚，0.1 mL/胚。鸡胚接种后置37 ℃继续孵育，连续观察144 h，同时设PBS对照组。试验重复3次。不同稀释度中和产物接种后的鸡胚死亡率计算同1.5。

1.7 中和剂鉴定试验 依照2002年版《消毒技术规范》(卫法监发〔2002〕282号)规定的试验程序，采用悬液定量法进行中和剂鉴定试验。3种消毒剂各设6组试验。第1组：消毒剂900 μL+病毒液100 μL；第2组：(消毒剂900 μL+病毒液100 μL)100 μL+中和剂900 μL；第3组：中和剂900 μL+病毒液100 μL；第4组：(消毒剂100 μL+中和剂900 μL)900 μL+病毒液100 μL；第5组：PBS液900 μL+病毒液100 μL；第6组：中和剂500 μL+ PBS 500 μL。基于1.5和1.6结果，为避免消毒剂对鸡胚的毒性作用，癸甲溴铵溶液和戊二醛苯扎溴铵溶液分别稀释1 000倍和100倍后使用。

上述各组中两两液体均于混匀后作用10 min。每组作用产物经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1 mL/胚。鸡胚接种后继续孵育并观察120 h。试验重复3次。

结果评判：第1、2、6组鸡胚应全部存活，其余3组全部死亡。

1.8 消毒剂对NDV灭活效果测定 采用悬液定量法进行。按消毒剂说明书推荐的最高使用浓度渐次稀释，将不同稀释度的消毒剂0.9 mL分别与0.1 mL 103倍稀释的新鲜病毒液混合，室温下分别作用10 min、 20 min和30 min。从消毒剂与病毒液不同时间作用产物中各取0.1 mL加入到0.9 mL中和剂中，混匀后作用10 min。中和后的溶液10倍系列稀释至10-4，将100、10-1、10-2、10-3和10-4五个稀释度溶液分别经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，0.1 mL/胚。同时设不加消毒剂的对照样品，以0.9 mL PBS代替消毒剂。鸡胚接种后置37 ℃继续孵育并观察120 h。采用血凝(HA)试验逐个测定死亡胚尿囊液鸡红细胞凝集价，然后根据测定结果分别计算各试验样品和对照样品的ELD50。试验重复3次。依下式计算不同浓度消毒剂对病毒的杀灭率[11]。以能完全灭活病毒的消毒剂最低浓度作为最低杀灭病毒浓度。

消毒剂对病毒杀灭率(%)=(对照样品ELD50-试验样品ELD50)/对照样品ELD50×100%

1.9 消毒剂连续使用稳定性试验 按产品使用说明书分别配制0.1 g/L癸甲溴铵溶液、5 g/L聚维酮碘溶液和10 mL/L戊二醛苯扎溴铵溶液(含戊二醛和苯扎溴铵各1 g/L)消毒工作液，室温下放置，定期取样测定其杀灭NDV的效果(方法同1.8)，观察消毒剂工作液的使用有效期。

2 结果

2.1 消毒剂对鸡胚的最大安全剂量 癸甲溴铵溶液和戊二醛苯扎溴铵溶液对鸡胚有一定的毒性作用，其稀释度分别≤1∶640和≤1∶80时，按0.1 mL/胚剂量经尿囊腔接种10日龄鸡胚，鸡胚可发生死亡。而聚维酮碘溶液对鸡胚基本无毒性。平均鸡胚死亡率结果见表2。

表2 消毒剂对鸡胚的最大安全剂量测定Table 2 Determination of the maximum safe doses of disinfectants to chicken embryo (%)

2.2 消毒剂与中和剂的中和产物对鸡胚的毒性 癸甲溴铵溶液和戊二醛苯扎溴铵溶液与相应中和剂的作用产物对鸡胚仍有一定的毒性，而聚维酮碘溶液与中和剂的作用产物对鸡胚无毒性。平均鸡胚死亡率结果见表3。

表3 消毒剂与中和剂的中和产物对鸡胚的毒性测定Table 3 Toxicity determination of neutralization products of disinfectants and neutralizers to chicken embryo (%)

2.3 中和剂鉴定 结果显示，3种消毒剂的第1、2、6组鸡胚均全部存活，其余各组鸡胚全部死亡(见表4)，表明选用的中和剂均可有效中和相应稀释度消毒剂的灭活NDV能力，其本身对鸡胚无毒性作用，也无灭活病毒能力。

表4 中和剂鉴定试验结果Table 4 Results of neutralizer appraisal tests (%)

2.4 消毒剂杀灭NDV的效果 结果表明，按作用10 min计，癸甲溴铵溶液、聚维酮碘溶液和戊二醛苯扎溴铵溶液完全杀灭NDV的最高稀释度分别为1∶20 000、1∶2 250和1∶3 750。按有效成分计，则癸甲溴铵最低杀灭NDV浓度为25 mg/L，聚维酮碘约为44.44 mg/L，戊二醛苯扎溴铵溶液为0.27 mL/L(含戊二醛和苯扎溴铵各约为26.67 mg/L)。此外，在一定浓度下，消毒剂的杀毒效果随作用时间的延长而增强。平均鸡胚死亡率结果见表5、6、7。

表5 癸甲溴铵溶液杀灭NDV效果测定Table 5 Virucidal efficacy of deciquam solution against Newcastle disease virus (%)

表6 聚维酮碘溶液杀灭NDV效果测定Table 6 Virucidal efficacy of povidone iodine solution against Newcastle disease virus (%)

表7 戊二醛苯扎溴铵溶液杀灭NDV效果测定Table 7 Virucidal efficacy of glutaral and benzalkonium bromide solution against Newcastle disease virus (%)

2.5 消毒剂连续使用稳定性 配制的3种消毒剂的消毒工作液，室温下放置，定期取样测定其杀灭NDV的效果。结果表明，5 g/L聚维酮碘工作液完全杀灭病毒的时间可保持10 d，存放15 d时，杀毒效果开始有所下降，至20 d时，作用10 min、20 min和30 min的病毒杀灭率分别降至0、12.24%和34.19%。此外，随存放时间的延长，液体的颜色逐渐变淡，直至无色。0.1 g/L癸甲溴铵工作液完全杀灭病毒的时间可保持135 d，存放150 d时杀毒效果开始下降。10 mL/L戊二醛苯扎溴铵工作液放置180 d依然保持完全杀灭病毒的效果。

3 讨论

本研究测定了3种消毒剂对鸡胚的最大安全剂量。结果表明，除聚维酮碘溶液外，癸甲溴铵和戊二醛苯扎溴铵溶液对10日龄鸡胚均有一定的毒性作用，中和剂也不能降低其毒性。因此在实际应用中应注意消毒剂的使用浓度，以免对动物造成伤害。

癸甲溴铵是一种双链季铵盐阳离子表面活性剂，其带正电荷的季铵阳离子能主动吸引并富集于带负电荷的病原表面，导致其膜的通透性发生改变，酶和结构蛋白变性，抑制病原的新陈代谢[12]。溴离子能渗透到胞浆膜脂质层及蛋白质层，改变膜的通透性。癸甲溴铵对多数细菌、真菌和藻类有杀灭作用，对亲脂性病毒也有一定作用。其残留药效长，对光和热稳定。适用于动物厩舍、饲喂器具、饮水等消毒。推荐使用浓度(以癸甲溴铵计)为：厩舍、器具消毒150～500 mg/L，饮水消毒25～50 mg/L。本研究发现，癸甲溴铵最低有效杀灭NDV浓度为25 mg/L，与推荐的最低使用浓度一致。

聚维酮碘系碘与1-乙烯基-2-吡咯烷酮均聚物形成的络合物，具有性能稳定、不挥发、易溶于水、无黄染等优点。它通过游离碘碘化和氧化病原体蛋白的活性基团，并与蛋白的氨基结合而导致蛋白质变性和抑制菌体的代谢酶系统，对细菌、病毒和真菌均有良好的杀灭作用[13]，是一种中效低毒的广谱消毒剂，特别适用于黏膜和创面消毒，也可用于饮水和养殖器具的消毒。本研究结果表明，聚维酮碘最低有效杀灭NDV浓度约为44.44 mg/L，远远低于推荐的最低使用浓度1 g/L。

戊二醛苯扎溴铵溶液是以戊二醛、苯扎溴铵为主要成分的复方消毒剂。戊二醛属醛类高效消毒剂，主要是通过醛基作用于病原体蛋白的巯基、羟基、羧基和氨基，使之烷基化，引起蛋白质凝固造成细菌死亡。具有广谱、高效、低毒、受有机物影响小、稳定性好等特点，可杀灭细菌的繁殖体和芽孢、真菌、病毒。苯扎溴铵又名新洁尔灭，为单链季铵盐阳离子表面活性剂，其作用机制与其他季铵盐类消毒剂相同。两者合用，具有增效作用。主要用于养殖水体、养殖器具的消毒。本研究结果表明，戊二醛苯扎溴铵溶液杀灭基因VII型NDV最低有效浓度约为0.27 mL/L，作用10 min。高富红等[8]报道戊二醛苯扎溴铵溶液杀灭NDV LaSota株的最低有效浓度为0.625 mL/L(1∶1 600稀释)，最短有效时间为5 min。鉴于他们试验中采用的是消毒剂与病毒液按1∶1比例的作用体系，因此，其实际最低有效浓度应约为0.313 mL/L，与本研究结果基本一致。

总之，在试验条件下，3种消毒剂在推荐使用浓度范围内，对NDV均有良好的灭活效果。其消毒效果与浓度及作用时间有一定的相关性，浓度越高，作用时间越长，消毒效果越强。需要注意的是，除消毒剂的浓度、作用时间外，环境温度、酸碱度、有机物的存在以及消毒方式(如喷雾、浸泡)等诸多因素均可影响其杀毒效果。在实际使用过程中，应采取规范的消毒方法和程序，如先对禽舍、器具进行彻底清扫、冲洗，待其干燥后再用消毒剂消毒，以保证消毒效果。

配制的消毒剂工作液稳定性试验结果显示，聚维酮碘和癸甲溴铵溶液完全杀灭NDV的时间可分别保持10 d和135 d，而戊二醛苯扎溴铵溶液至少可保持180 d，基本与它们各自的理化特点相符。然而，在实际消毒工作中，配制的消毒液应尽可能现配现用，避免长时间存放。