犬DEA1.1血型抗体间接ELISA检测方法的建立

隋君霞，隋京京，李 晓，姜忠玲，曹荣峰，丰艳妮，李华涛

(青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

在临床治疗中，犬的血型是输血疗法的决定因素，血型不合可能造成严重的溶血反应，导致治疗失败或留下严重的后遗症[1]。在犬的血型系统中，DEA1.1、DEA1.2表现出较强的免疫原性[2]，DEA1.1和DEA1.2的抗原-抗体反应也是导致急性输血性溶血的最主要因素[3]。因此在犬临床输血治疗中，鉴定DEA1.1血型是非常有必要的。目前动物血型分型方法主要有试管法、卡片法和凝胶柱法[4]，这些方法都是基于红细胞抗原和单克隆试剂或多克隆血清的血凝反应原理实施的[5]。目前仍未发现一种能够用于犬交叉配血检测的金标准，现行的方法或是缺乏准确性；或是价格昂贵、国内尚未推广；或是无法用于大批量血液样本检测[6]，因而亟需研发一种检出率高、价格合理且能够用于大批量血型筛查的新方法。在本试验中，我们通过几种醛化剂对犬DEA1.1抗原红细胞进行醛化固定，并进一步研究醛化对血型抗原DEA1.1是否造成影响，并探索一种使犬DEA1.1血型抗原得以长期保存的方法。通过提取犬红细胞膜，去除血红蛋白成分，以特定血型的红细胞膜为抗原建立间接ELISA方法用以宠物医疗中血型高通量检测，降低因血型不合引起的输血风险。

1 材料

犬血液样本来自广州及周边地区动物医院、流浪犬收留中心及品种犬养殖基地，其中试验用比格犬130只、本地犬28只，共计158个样本。QuickVet®/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test试剂盒，购自美国Dmslaboratories公司； HRP酶标抗犬IgG二抗，购自BD公司；96孔聚苯乙烯酶标板或8孔酶标板条为Breiner bio-one公司产品；脱脂奶粉、BSA、TMB，均购自北京Solarbio公司。

2 方法

2.1 犬DEA1.1血型鉴定 按照QuickVet®/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test说明书对犬DEA1.1血型进行检测。检测原理是当红细胞细胞膜上含有DEA1.1抗原时，会和鉴定卡上的DEA1.1单克隆抗体相结合而产生凝集反应，被检测的血样为DEA1.1阳性，不产生凝集反应则被检测血样为DEA1.1阴性。

2.2 犬DEA1.1血型抗原间接ELISA方法的建立 由于对DEA1.1抗原了解较少，目前还不能用真核或原核表达的情况下得到血型抗原，也不能拿到较纯DEA1.1抗原，因此最初尝试用DEA1.1抗原阴、阳性的犬红细胞膜为抗原，进行DEA1.1血型抗原间接ELISA方法的建立。

2.3 红细胞膜制备 红细胞的采集和洗涤：取2 mL 抗凝全血3 000 r/min离心20 min，红细胞沉淀，弃上清和白细胞层。将红细胞置于3倍量的预冷pH 7.4的等渗磷酸盐缓冲液中，混匀，4 ℃5 000 r/min 离心15 min，除去上清及沉淀表层，重复洗涤3次。红细胞膜洗涤：在洗净的红细胞中，按照1∶40的比例加入预冷的pH 7.4的低渗Tris缓冲液中，混匀，置于4 ℃冰箱中2 h，使之完全溶血。4 ℃ 9 000 r/min离心15 min，使红细胞膜沉淀，重复洗涤，离心3～5次，最后获得白色的红细胞膜样品。将最后1次离心所得到的红细胞膜悬浮在2～4 mL pH 7.4的等渗磷酸盐缓冲液中。记录悬浮液的总体积。

2.4 间接ELISA方法操作程序 细胞膜包被液摸索：分别选用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)、0.05 mol/L包被液(pH 9.6的碳酸盐缓冲液)、0.5%PVA包被红细胞膜到酶标板上，每孔加100 μL包被液，4 ℃ 过夜，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)振摇洗涤酶标板3次，每次5 min。细胞膜固定剂摸索：分别选择甲醛、多聚甲醛、戊二醛固定犬红细胞，用间接抗球蛋白试验检测对犬血型DEA1.1的抗原性影响；根据结果选择最佳固定剂，设置浓度梯度为0.02%、0.03%、0.06%、0.13%、0.25%和0.50%固定犬红细胞膜，按50 μL/孔加入到酶标板中。37 ℃作用2 h。 用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)振摇洗涤酶标板3次，每次5 min。封闭：分别加入5%的脱脂奶粉、1%的BSA、0.1%的BSA，200 μL/孔，置37 ℃温箱2 h，取出后甩掉液体，用PBS充分洗涤。加血清：用封闭液按1∶200稀释犬抗DEA1.1抗血清和阴性血清，加入到反应板中，100 μL/孔，每份样品再重复1孔，同时设定阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔，置37 ℃温箱作用一定时间，取出后甩掉液体，用PBS充分洗涤。加酶标二抗：将酶标二抗用封闭液按1∶200稀释，加入到反应板中，100 μL/孔，置37 ℃温箱作用一定时间，取出后甩掉液体，用PBS充分洗涤。加底物溶液：取现配制的TMB-H2O2底物溶液、TMB显色液100 μL/孔，加入到反应板中，置37 ℃温箱作用一定时间。加终止液：取出反应板，加入终止液2 mol/L H2SO4，100 μL/孔，终止显色反应。酶标仪测定：用酶标仪在单波长处测定每孔内物质的OD490 nm值。

结果判定：在对照成立的情况下，判定检测血清样品的阴阳性。通过对每次反应的数据进行处理，计算反应的P/N值，以P/N值最大的反应条件作为间接ELISA最佳反应条件的判定依据。P/N值计算方法：P/N值=(阳性对照孔OD490 nm平均值-空白对照孔OD490 nm均值)/(阴性对照孔OD490 nm均值-空白对照孔OD490 nm均值)。

2.5 间接ELISA反应条件的优化 将提取的红细胞膜用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)按照2倍倍比稀释，每孔加30 μL于酶标板，添加1%戊二醛PBS 2 μL， 使终浓度为0.062 5%。37 ℃包被2 h，根据检测结果，确定最佳抗原包被浓度。以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，分成4组进行。第1组用5%脱脂乳封闭；第2组用1%脱脂乳封闭；第3组用5% BSA封闭；第4组用1% BSA封闭。按照间接ELISA程序测定OD450 nm值，比较P/N值，以确定最佳封闭液。随机收集健康犬血清56份，分别稀释至最佳浓度，用已建立间接ELISA方法检测，每份血清重复2孔，DEA1.1阴性、阳性血清作为对照。测定OD450 nm值并进行统计学分析。加入血清稀释液之后，分别在室温(26 ℃)和37 ℃作用30、60、90、120、150 min后测定其OD450nm值，确定血清最佳反应时间。加入新配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，于室温反应10、15、20、25、30 min，用2 mol/L H2SO4终止反应，以P/N值最大为判定标准。

2.6 间接ELISA重复性试验验证 稳定性和重复性：红细胞膜在-20 ℃长时间保存，反复冻融20次，固定于ELISA板4 ℃保存后进行检测。板内重复试验：用同一块酶标板加入不同的样本，包括阳性样本4份，阴性样本2份，阳性对照和阴性对照各1份。阳性和阴性样本各做6个重复。用建立的ELISA检测方法测定，计算同一样本的变异系数，以检验板内样品的重复性。板间重复性试验：取不同时间包被的6个酶标板重复检测上述4份阳性样品和2份阴性样本，并设阳性和阴性对照，用建立的ELISA方法进行检测，计算同样本的变异系数，以检验板间检测样品的重复性。对比试验(特异性)：与间接抗球蛋白试验相比，观察2种方法的特异性。提取158只犬红细胞膜用DEA1.1抗血清进行细胞抗原检测。用其中1份DEA1.1抗原阳性的细胞膜对158份犬血清进行DEA1.1抗体检测，观察ELISA方法的特异性。

3 结果

3.1 细胞膜包被液及固定剂的摸索 用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)、0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)和0.5%PVA包被。ELISA结果显示，所有的孔OD值均很低，并且阴阳性红细胞膜对比没有明显差别。认为常用的ELISA包被液不能把完整或大块的红细胞膜包被到酶标板上。用甲醛、多聚甲醛和戊二醛固定红细胞后，间接抗球蛋白试验检测结果显示，几种固定剂并不影响犬血型DEA1.1的抗原性，但发现长时间保存后，甲醛和多聚甲醛会使红细胞溶血。戊二醛增加红细胞的粘性，并能使整个红细胞固定到酶标板上。选择戊二醛作为固定剂固定包被红细胞膜，进行ELISA检测。结果显示，戊二醛可以很好的把整个的红细胞膜固定到酶标板上。并且不影响犬血型DEA1.1的抗原性。阴阳性血清检测结果P/N值随戊二醛浓度变化而变化(如表1和图1)。0.06%和0.13%最接近，P/N>2，但是结果所得数据离散度较大，同一样本重复性不好。

表1 P/N值随戊二醛浓度变化Table 1 P/N value affected by concentration of glutaraldehyde

图1 P/N值随戊二醛浓度变化Fig.1 P/N value affected by concentration of glutaraldehyde

3.2 抗原包被浓度和阳性血清稀释度的确定 将提取的红细胞膜用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)按照2倍倍比稀释，结果如表2和图2所示，抗原浓度在4～8 μg时， P/N值最大。认为最佳抗原包被量为4～8 μg/孔。 血清在800倍稀释时P/N值小于2。被检血清稀释400倍时能检出。与间接抗球蛋白试验相比，比抗球蛋白结果试验灵敏2倍以上(表3和图3)。

表2 抗原包被浓度的优化Table 2 Optimize the concentration of antigen-coated

图2 抗原包被量的优化Fig.2 Optimize the concentration of antigen-coated

图3 间接ELISA方法灵敏度测定Fig.3 Sensitivity measurement of ELISA

表3 间接ELISA方法灵敏度测定Table 3 Sensitivity measurement of ELISA

3.3 封闭液的确定 以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，分别用4种不同的封闭液进行封闭，结果反映，4种封闭液之间没有明显的差异，用5%的脱脂奶粉封闭液封闭特异性结合最低，所以选择5%的脱脂奶粉作为封闭液。

3.4 血清反应时间和反应温度的确定 如表4和图4结果所示，37 ℃反应90 min时P/N值可以达到最高值，26 ℃反应120 min时才可以达到最大值，进入平台期。37 ℃为反应的最佳温度。37 ℃反应90 min时P/N值基本达到最大，之后的P/N变化不大。本试验优化的结果是反应温度为37 ℃，反应时间为90 min。

表4 优化血清反应时间和反应温度Table 4 Optimization of serum reaction time and temperature

图4 优化血清反应时间和反应温度Fig.4 Optimization of serum reaction time and temperature

3.5 稳定性和重复性 -20 ℃长时间保存并不影响检测结果。反复冻融20次也不影响检测结果。固定在ELISA板4 ℃保存后发现2个月内不影响检测结果。说明犬血型DEA1.1抗原具有很高的稳定性，可以长期保存抗原，替换掉试剂红细胞。应用建立的间接ELISA方法对血清样品进行批内和批间重复试验，结果显示，阳性血清仍为阳性，阴性血清仍为阴性结果，说明间接ELSIA具有较好的重复性。

3.6 对比试验(特异性) 结果显示，2种方法相比，提取158只犬红细胞膜用DEA1.1抗血清进行细胞抗原检测和抗体检测结果与间接抗球蛋白试验结果符合率为100%，具有相同的特异性。

4 讨论

目前，在兽医临床上缺乏准确、简便和便宜的犬血型鉴定试剂。由于红细胞常规保存方法较短，针对多种不同血型的红细胞又很难收集并应用到免疫血清和单克隆抗体的筛选。本试验根据国际现有的多克隆抗血清和犬DEA1.1血型检测卡，对广州地区本地犬和试验用比格犬就行筛查。并以此为基础选择DEA1.1血型强阳性和阴性的犬作为试验动物。

研究证明，通过特殊酶如菠萝蛋白酶处理红细胞增加DEA1.1血型检出率，并通过抗球蛋白对照确认DEA1.1血型抗原位点存在于红细胞膜蛋白上[7]。醛化剂的醛基可以和红细胞膜上蛋白质的氨基交联形成羧甲基，能使红细胞蛋白分子之间形成交联，影响蛋白构型使之保持固有的形态结构[8]。有文献报道用干燥固定的方法[9]，或甲醛固定的方法固定红细胞到96孔板中[10]，建立的ELISA方法可以用于抗体的检测。但是在本试验预试验进行了验证，由于红细胞内部存在血红蛋白，具有过氧化物酶的作用。会引起底物TMB发生显色反应，因此基本不能使用。为了解决犬DEA1.1抗原长期保存的问题，本试验探索了多种固定剂对犬红细胞进行固定，最终发现戊二醛具有很高的固定作用，并且不会破坏犬DEA1.1血型抗原活性。因此，戊二醛固定红细胞可以在HA试验代替新鲜的红血细胞。同时，它为制备DEA1.1单克隆抗体提供了基础。

本试验对已有的红细胞抗体ELISA检测法[11]做了进一步的改进，提取红细胞膜的目的是为了去除红细胞内部的血红蛋白，降低对反应底物TMB的影响。经探索发现，戊二醛能把红细胞膜牢固的固定到96孔板底部。从而提高了蛋白量差异较大的难题。虽然解决了很大的问题，在结果判定过程中，发现阴阳性结合检测所得到的P/N值差异很小，不像其他文献报道的ELISA方法[12]，很明显的判断出阴阳性的差别。对于此方法，本试验虽然做了改进，也能很稳定的检测出阴阳性，但是其灵敏度并不是特别高。本试验为研制犬DEA1.1血型单克隆抗体打基础，建立了犬DEA1.1血型抗原间接ELISA方法，可以对犬DEA1.1血型抗体进行高通量检测。