知母种子质量检验方法研究

时凯旋，赵凯旋，訾明茹，李 贺，马春英

(河北农业大学农学院，河北 保定 071000)

知母是我国传统的常用药材，为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根茎，具有清热泻火、滋阴润燥的功效。用于外感风热，肺热燥咳，肠燥便秘等症。知母主产于山西、河北、内蒙古等地，其中河北易县一带是知母的道地产区，称“西陵知母”。随着知母药材出口量和国内市场需求量的不断增加，野生知母的资源濒危，人工栽培知母逐渐进入市场。目前，河北省是人工栽培知母的主要产区，据2017年统计数据，河北省知母的种植面积超过4 000 hm2。

中药材质量受多方面因素的影响，其中种子是中药材生产的源头，种子质量的真伪优劣直接影响药材的产量与质量。因此，开展中药材种子质量检验研究，是我国中药材规范化生产急需解决的重要问题[1]。目前，关于药用植物种子质量标准研究常见报道[2,3]，其中，中药材种子检验和质量标准多是参照我国农作物种子的检验和质量标准，但是种子特性不同，适合的种子指标检验方法不同。以含水量测定为例，王书云等对金银花种子含水量测定中发现，采用低温[(105±2)℃]烘干3 h后无显著变化[4]；杨敏等对肉苁蓉种子含水量测定中发现，采用高温[(130±2)℃]烘干12 h后无显著变化[5]。由此可见，建立不同种子的质量检验方法非常必要。

本实验以药用植物知母种子为材料，选择千粒重、含水量、发芽率、生活力4个代表种子质量的重要指标，展开对4个指标测定方法的探索和研究，旨在确定知母种子千粒重、含水量、发芽率和生活力的检验方法，以期为知母种子质量检验规程的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

知母种子于2018年在安国药博园随机选2份果穗，带回河北农业大学实验室脱粒，开展实验。

1.2 仪器和试剂

BIC.250人工气候箱，DHG-9240 A电热恒温鼓风干燥箱，电子天平，水浴锅，培养皿，温度计，烧杯，镊子，刀片，发芽盘；蛭石，营养土，TTC粉末(批号：No.101100032)

1.3 方 法

1.3.1千粒重测定

按照农作物种子检验规程(GB/T 3543-1995)[6]中重量测定法执行。本实验分别采用百粒法、五百粒法及千粒法测定知母种子千粒重。具体方法如下：从供试样品中随机数取100，500，1 000粒净种子，用电子天平称重，并分别重复8次、3次和2次，记录其重量。

1.3.2含水量测定

按照农作物种子检验规程(GB/T 3543-1995)[6]中水分测定法执行。本实验采用高温烘干法：分别在(133±2)℃高温条件下，设置1、2、3、4、5、6 h对种子含水量进行测定。每份处理重复4次，每次称重(2.500±0.005)g。将种子于(133±2)℃下烘干，每隔1 h测定种子质量并记录。

种子含水量=[(烘干前供检种子质量-烘干后供检种子质量)/烘干前供检种子质量]×100%。

1.3.3知母种子生活力测定方法探究

按照种子常规检验方法TTC染色法[7]进行。本实验采用3因素4水平正交试验设计探索知母种子生活力测定条件，TTC染色时间设2、3、4、5 h，浓度设0.10%、0.20%、0.40%、0.50%，温度设25、30、35、40 ℃。随机数取1号种子，每个处理100粒，为了更准确的探究知母种子生活力测定条件，本实验选取饱满的知母种子。在30～35 ℃温水中浸泡24 h后，用刀片将吸胀的种子沿种子胚中心线纵切成两半，将其中的一半置于培养皿中，用TTC溶液染色并置于恒温培养箱中；将另一半在沸水中煮5 min杀死胚，同样方法进行染色处理，作为对照观察。染色结束后，沥去溶液，用清水冲洗，将种仁摆在培养皿中，逐一观察知母种子染色情况，记录并计算活种子的百分率。

种子生活力(%)=(染色种子个数/待测种子总数)×100%。

种子着色的标准为胚完全着色，并呈现红色为有生活力。胚着色浅，呈粉色的为生活力弱的种子,在本实验中，将着色浅的和不着色的都归为无生活力种子[7]。

1.3.4发芽率测定

按照农作物种子检验规程(GB/T 3543-1995)[6]进行发芽试验。采用营养土和蛭石2∶1的比例为发芽床，设15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃ 4个处理，每个处理重复4次，每个重复50粒种子，放入人工气候箱中培养，随时补给水分，保持营养土湿润。以胚轴伸出营养土2 mm为发芽标准，每天09：00时观察知母种子发芽情况并记录，计算知母种子发芽势，观察至第15天，统计知母种子发芽总数并计算发芽率。

发芽势(%)=(发芽高峰期发芽的种子数/供试种子数)×100%；

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子数)×100%。

1.3.5统计方法

应用SPSS 21.0软件对试验结果进行统计分析，得出知母种子质量检验方法。

2 结果与分析

2.1 知母种子千粒重分析

由表1可知，2份种子百粒法、五百粒法和千粒法的变异系数均未超过3.0%，千粒法测定变异系数最小，平均值为0.661%。经统计分析，3种方法间差异性不显著(p>0.05)，均可作为知母种子千粒重的测定方法。考虑到时间成本等因素，知母种子千粒重测定可以用百粒法。

表1 知母种子重量测定结果

2.2 知母种子含水量分析

知母种子在高温(133±2)℃下烘干4～5 h后，含水量基本保持稳定，且在5～6 h内无显著变化，综合2份种子情况，高温烘干法测定知母种子宜选择在高温(133±2)℃下烘干5 h(表2)。

表2 不同烘干时间知母种子含水量比较(n=4)

2.3 知母种子生活力分析

本实验采用3因素4水平的正交试验设计，利用TTC染色法对1号知母种子进行生活力测定。影响知母种子胚着色率因素的主次关系是：TTC浓度对知母种子胚着色率影响最大，时间影响次之，温度影响最小；TTC浓度方差分析显示：随着TTC浓度升高，知母种子胚着色率呈先升后降的趋势，TTC浓度为0.2%时，知母种子胚着色率最高，之后开始下降。极差分析结果显示：知母种子生活力测定的适宜条件为TTC浓度0.2%，染色时间5 h，染色温度35 ℃(表3)。

表3 四唑不同处理对知母种子生活力检测(n=100)

2.4 知母种子发芽率、发芽势分析

在对知母种子进行发芽率实验过程中，以胚轴伸出营养土2 mm时为初次计数时间。结果表明：15 ℃、20 ℃条件下知母种子在第10天开始发芽，发芽速度慢，发芽过程中未出现发芽高峰，所以没有计算知母种子发芽势；25 ℃、30 ℃条件下知母种子在第4天开始发芽，第7天发芽数最多，所以25 ℃、30 ℃条件下发芽势依据第7天的种子发芽数计算；15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃条件下均在第15天种子萌发达到最高且以后再无种子萌发，所以第15天为末次计数时间。结果表明，15 ℃下2份种子几乎都不发芽；20 ℃下2份种子发芽率均较低；15 ℃、20 ℃下知母种子发芽率与25 ℃、30 ℃下知母种子发芽率差异性显著；25 ℃下种子发芽率、发芽势与30 ℃下差异性不显著，考虑到30 ℃下种子发芽需水量大等实际情况，选择25 ℃为知母种子的最适发芽温度(表4)。

表4 不同发芽温度下知母种子发芽情况比较(n=3)

3 讨 论

种子检验是农业生产上控制种子质量的必须手段，通过检验可以确定种子在生产中的利用价值，种子是农业增产增效的根本因素，种子质量好坏决定了现代农业高质量发展水平，种子质量监控体系的建立和推行，是提高和保障种子质量的重要举措[8]。近年来，药用植物需求量增加，野生药用植物数量不能满足需求，栽培药用植物已经纳入药材体系，在栽培药用植物过程中，种子是源头，种子质量优劣直接影响中药材的质量与产量，开展中药材种子质量检验研究十分必要。

衡量种子质量的指标有很多，金银花种子质量标准制定中选用了真实性鉴定、净度、含水量、千粒重、胚率、生活力和发芽率等指标[4]，连翘种子质量标准制定中选用了净度、千粒重、含水量、生活力和发芽率等指标[9]，黄芩种子质量标准制定中选用了千粒重、形态大小、含水量、饱满度、生活力和发芽率等指标[11]，这些种子质量标准均参照《中国农作物种子检验规程》，但综合这些文献，千粒重、含水量、发芽率和生活力是共有的指标，说明在制定药用植物种子质量标准中这4个指标比较重要，所以，本实验以知母种子为实验材料，对千粒重、含水量、生活力和发芽率4个指标的检验方法进行了探索，旨在确定知母种子质量指标的检验方法，为开展药用植物种子质量研究提供依据。

《中国农作物种子检验规程》规定种子含水量测定有高温烘干法(133±2)℃和低温烘干法(105±2)℃ 2种方法。李书敏等[9]对连翘种子含水量测定后确定采用高温法烘干，刘钰萍等[10]对红花种子含水量测定后确定采用低温法烘干8 h。邢丹等对知母种子含水量的2种烘干方法进行探究，结果表明：高温下需烘干5 h，低温下需烘干15 h，且二者差异不明显[7]。考虑到低温烘干法耗时长，本实验知母种子含水量测定采用高温烘干法(133±2)℃，烘干5 h后含水量无显著变化，与邢丹等[7]的实验结果一致。

葛人杰等对黄芩种子质量的分级标准研究中发现，不同产地黄芩种子在千粒重、生活力和饱满度等特性方面均有差异，且不同产地种植环境与气候均不同，因此适宜不同产地黄芩种子的发芽温度也不同[11]。药用植物种子的发芽温度是由种子的特性决定的，或者与药用植物的起源地有关。因此，本实验分别探究知母种子在15、20、25、30 ℃下的发芽率和发芽势，以期获得知母种子在北方的适宜发芽温度。实验表明，25 ℃为最适发芽温度。

植物种子生活力快速检测时普遍采用TTC染色法，牧草种子生活力标准中采用浓度为0.5%TTC溶液[12]。邢丹等[7]和尤丽霞等[13]在对知母种子活力测定时同样选用的是高浓度(0.5%)的TTC溶液。本实验发现，随着TTC浓度的提高，知母种子活力表现出先升后降的趋势，浓度为0.2%TTC种子生活力最大，这与李书敏等[9]的实验结果一致。这可能与知母种子胚中脱氢酶有关，种子胚内底物在脱氢酶的催化作用下将氢传递给TTC，TTC进一步转化为红色物质，而且TTC溶液本身具有毒性，对酶活性与产物均有抑制，因此TTC溶液浓度过高或过低均会影响脱氢酶的转化作用[14]。

通过本实验，对药用植物知母种子的质量检测指标千粒重、含水量、生活力和发芽率的测定建立了相应的标准。千粒重测定用百粒法；含水量测定，采用高温法(133±2)℃下烘干5 h；生活力测定TTC浓度0.2%，染色温度35 ℃，染色时间5 h；发芽温度为25 ℃。为知母种子或其他药用植物种子质量标准的制定提供了依据，为药用植物的规范化种植提供了源头上的标准。