一种滴滴涕胶体金免疫快速检测试纸条的研制

□ 万宇平 何方洋 贾芳芳 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技术有限公司 北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心

□ 郑百芹（通信作者） 唐山市食品药品综合检验检测中心

引言

滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，简称“DDT”）是一种高毒有机磷杀虫剂，其应用广泛，因对害虫有触杀、胃毒等作用而被用于防治蚊蝇和臭虫[1-3]。由于该药物化学性质较为稳定，容易富集污染环境，并可通过食物链进入人体而危害健康。因此，早在2009年，我国就已全面禁止了滴滴涕的生产、使用和进出口。但时至今日，仍有部分养殖户使用滴滴涕作为杀虫剂，故对该农药残留进行检测具有必要性[4-6]。

目前，检测滴滴涕的方法大多为仪器方法[7-14]，但此类方法成本较高、检测时间长、操作复杂，不符合基层实验室高效、便捷的检测要求。因此，本研究制备出一种滴滴涕的单克隆抗体，将其应用于胶体金免疫快速检测试纸条，可实现高效、便捷的检测。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等标准品（纯度≥95%），购自北京标准物质研究中心；柠檬酸三钠、碳酸钾，购自北京百欣试剂公司；样本提取剂、样本复溶液、胶体金分析仪，由北京勤邦生物技术有限公司提供；涡旋仪、均质器，购自湖南湘立科学仪器有限公司[15-16]。

图1 滴滴涕半抗原合成

1.2 方法

1.2.1 滴滴涕半抗原的制备

取1.7g邻氯苯乙酸，加5mL氯苯，再加入1.8g水合氯醛，加热至完全溶解后，加入三氯化铝5.38g，室温搅拌5h，停止反应，加水80mL和乙酸乙酯120mL，萃取分离，分去水相，有机相无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯（v/v，1/1）洗脱分离，得到乙酸滴滴涕半抗原产物1.8g，收率43.9%。

1.2.2 免疫原的制备—滴滴涕半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联物合成

取乙酸滴滴涕半抗原产物15mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC13.7mg和NHS10.9mg，充分混匀后，反应4h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白（BSA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液。将A液滴加到B液中，4℃反应24h后0.02M PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到滴滴涕-BSA偶联物，即免疫原，分装后于-20℃保存。

图2 滴滴涕胶体金试纸条结果判定示意图

1.2.3 免疫原的制备—滴滴涕半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联物合成

取乙酸滴滴涕半抗原产物9mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC7.6mg和NHS6.8mg，充分混匀后反应4h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白（OVA）50mg，加 0.05M PB溶解，得到 B液。将A液滴加到B液中，4℃反应24h后0.02M PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到滴滴涕-OVA偶联物，即免疫原，分装后于-20℃保存。

1.2.4 将滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

将滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物加入到微孔板中，冷冻干燥，得到滴滴涕单克隆抗体-胶体金标记物冻干的微孔试剂[15-16]。

1.2.5 检测方法

向微孔中加入100μL待检样本溶液，混匀，室温下培育3min。吸取70μL溶液滴至试纸条上，反应10min，根据示意图判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果[15-16]。

1.2.6 样本检测限

在空白蔬菜、水果、饲料、牛奶样本中分别添加滴滴涕标准品至质量浓度为0、4、4.5、5、5.5、6μg/L，按照“1.2.5”所述方法用3批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限[15-16]。

1.2.7 试纸条的特异性

分别配制500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等药物，用胶体金免疫快速检测试纸条进行检测，重复测定3次，判断试纸条的特异性[15-16]。

1.2.8 准确性

农业部文件要求：以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性[15-16]。取经过仪器确证的50份阴性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品（质量浓度小于5μg/kg）与50份阳性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品（质量浓度大于5μg/kg），用胶体金免疫快速检测试纸条检测滴滴涕的残留量，计算假阳性率和假阴性率[15-16]。《农残办技术材料要求及审查程序》规定：试纸条假阳性率应小于5%，假阴性率应为零[15-16]。

表1 滴滴涕快速检测试纸条的检测限

表2 特异性测定

1.2.9 试纸条的稳定性

将试纸条保存于2～8℃环境中，每隔1个月检测试纸条的准确性，连续测定15个月[15-16]。具体方法为：分别检测经过仪器确证的20份阴性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品（质量浓度小于5μg/kg）与20份阳性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品（质量浓度大于5μg/kg），重复测定2次，根据实验结果判定试纸条的稳定性[15-16]。

2 结果与分析

2.1 样本检测限

配置滴滴涕浓度分别为0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、饲料、牛奶样品，按照“1.2.5”步骤进行检测，确定检测限[15-16]。结果显示，该试纸条的检测限为5μg/kg，见表1。

2.2 特异性

用试纸条检测500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等药物，结果均呈阴性（见表2），表明该试纸条特异性较好[15-16]。

2.3 准确性

用试纸条检测50份阴性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率低于5%；用试纸条检测50份阳性蔬菜、水果、饲料、牛奶样品，检测结果均为阳性（见表3），说明该试纸条假阴性率为零，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求[15-16]。

表3 准确性测定

2.4 稳定性

试纸条保存12个月内，其假阳性率和假阴性率的检测结果均符合要求；之后试纸条会出现少量失效、假阴性等现象[15-16]（见表4）。

3 讨论

目前，有关检测滴滴涕的文献较为有限，本研究通过制备滴滴涕半抗原，让其与载体蛋白偶联得到免疫原，最终制备出商品化的胶体金免疫层析试纸条。按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求，对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试，均符合要求。此外，该试纸条的检测时间仅为15min，比现有文献中仪器方法用时更短，操作更简便。