NRF2/PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究

段俊伟 倪文

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种实质性脏器的高恶性度肿瘤，疾病进展快，预后多不佳[1]。肝癌治愈的唯一方法仍为手术切除，化疗药物已成为治疗肝癌的治疗手段之一，但肝癌细胞对不少化疗药物存在明显耐药，增加了临床治疗难度[2]。随着分子靶向治疗药物的不断开拓，索拉非尼是 NCCN 指南推荐的晚期肝癌治疗的首选方案[3]。 但索拉非尼长期服用会出现耐药，延长肝癌患者生存期仅不足 3 个月，最终导致治疗失败[4]。索拉非尼于2008年作为第一个HCC的全身治疗药物获批上市，索拉非尼在临床上的口服制剂为多激酶抑制剂，可抑制VEGF、KIT以及下游Raf信号等并直接抑制肿瘤的增殖以及肿瘤新生血管的生成[5,6]。本研究拟首先建立亲本SMMC-7721细胞株以及SMMC-7721-SR耐药株，而后检测索拉非尼对细胞活性的抑制作用，借此探讨NRF2/PI3K相关通路与HCC患者索拉非尼耐药发生风险之间的关联机制。

资料与方法

一、细胞株的培养建立

亲本的SMMC-7721细胞株培养通过将细胞株均接种于胎牛血清完成(胎牛血清，取浓度10%，且含高糖 DMEM)，培养箱孵育(孵育条件： 37 ℃、5% CO2)；随后将肝癌SMMC-7721细胞在索拉非尼培养液中培养(0.5 μmol/L)，待培养稳定后使用浓度梯度递增法完成耐药细胞株的建立(即SMMC-7721-SR细胞株)，直至细胞能在索拉非尼的培养液中稳定生长。

二、NRF2-siRNA质粒构建和转染

构建NRF2-siRNA质粒，按照 lipofectamine 2 000 的操作说明对肝癌细胞SMMC-7721进行转染，验证质粒及 siRNA 的转染效率。siRNA 序列参照文献设计并由上海吉玛制药技术有限公司合成。 序列为：(1)NRF2 正义链：GCACCUUAUAUCUCGA-AGUTT；反义链：ACUUCGAGAUAUAAGGUGC-TT。对照siRNA:正义链：UUCUCCGAACGUGUC-ACGUdTdT；反义链：ACGUGACACGUUCGGAG-AAdTdT。

三、细胞存活率的测定

细胞存活率测定在本次研究中使用CCK-8法检测完成：抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后，SMMC-7721细胞株及SMMC-7721-SR细胞株换培养液后接种于96孔板中，换培养基继续培养(培养基添加10ul 的CCK8，培养时间2 h)，测定OD值，计算细胞存活率。

四、细胞凋亡率的测定

对于SMMC-7721细胞株，抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理，完成细胞株以及耐药株细胞悬液的制作，采用TUNEL试剂盒进行逐步操作。在显微镜下查找荧光阳性细胞，判断SMMC-7721细胞株及SMMC-7721-SR细胞的凋亡率。

五、检测相关 mRNA表达

借助Real-time PCR完成相关mRNA 的定量测定，使用Trizol提取总RNA，逆转录，完成PCR实验。比较阈值循环数(cycle threshold, CT)值等。

六、Western Blot检测NRF2、Keap1、ARE以及PI3K、Akt蛋白的表达

取肝癌细胞冰上裂解2 h并低温离心，提取组织中蛋白上清液，加入20 μg/μL蛋白样品至SDS凝胶(10%)，电泳转膜，随后分别加入对应的抗体，使用碱性磷酸酶二抗进行抗体孵育，显色剂DAB显色。计算各组条带中NRF2、Keap1、ARE、PI3K和Akt蛋白表达量。

七、统计学处理

结 果

一、细胞存活率测定结果

索拉非尼可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的存活率(P<0.05)，索拉非尼对SMMC-7721-SR细胞存活率没有明显影响(P>0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后，SMMC-7721-SR细胞存活率明显降低(P<0.05)。

二、细胞凋亡率测定结果

与对照组对比分析结果提示，索拉非尼可增加SMMC-7721 凋亡 (P<0.05)；与耐药细胞株对比，其对SMMC-7721的凋亡促进作用更强(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理，耐药细胞凋亡率增加(P<0.05)。

四、Real-Time PCR检测基因水平表达

SMMC-7721-SR细胞中NRF2 mRNA表达明显高于SMMC-7721细胞，Keap1、ARE、PI3K和Akt mRNA表达明显增加(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后，NRF2、Keap1、ARE、PI3K和Akt mRNA表达明显降低(P<0.05)。

五、Western Blot检测蛋白含量表达

SMMC-7721-SR细胞中NRF2 蛋白水平明显高于SMMC-7721细胞，Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白水平明显增加(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后，NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt 蛋白水平明显降低(P<0.05)。

讨 论

肝癌作为第六大最常见的恶性肿瘤，占新发癌症病例的5.7%，也是全球癌症相关死亡的第二大杀手[7]，在成人的原发性肝肿瘤中，肝细胞癌(HCC)是最常见的[8-9]。索拉非尼单独或与其他药物联合进行局部靶向干预可以有效增加晚期肝癌患者的生存时间，美国 FDA已经批准认可索拉非尼作为干预晚期肝癌的重要靶向药物[10]。索拉非尼的抗肿瘤功效主要通过抑制 Raf MEK ERK相关通路，可以有效阻止肿瘤的生长，与此同时其还可以调控VEGF表达，间接减低肿瘤发生和进展[11-14]。但长期服药索拉非尼，会引起患者出现获得性耐药[15]，因此探讨相关耐药机制并在此基础上开发有效阻控干预意义重大。

本次研究中可见索拉非尼对肝癌细胞SMMC-7721的存活率具有明确的抑制作用，促进细胞株凋亡；索拉非尼耐药细胞株中肿瘤细胞凋亡明显减少。提示索拉非尼可以有效抑制SMMC-772活性，索拉非尼作用下，SMMC-7721细胞NRF2 蛋白水平及mRNA含量增高，另外本研究中分析的几种蛋白水平也可见高表达，并且相关mRNA表达也增加，提示索拉非尼调控NRF2/PI3K信号通路，但对耐药株SMMC-7721-SR的促凋亡作用并不明显。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后，耐药株SMMC-7721-SR细胞中NRF2/Keap1通路蛋白水平明显降低，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率升高。说明肝癌细胞下调siRNA-NRF2 基因后，促进了耐药株SMMC-7721-SR细胞出现凋亡，而非耐药SMMC-7721细胞株索拉非尼单药效果更为敏感， 抑制 NRF2 可逆转肝癌对索拉非尼耐药，索拉非尼持续作用直接导致NRF2/PI3K通路的激活，引发肝癌对索拉非尼获得性耐药。

表1 索拉非尼处理SMMC-7721细胞和SMMC-7721-SR细胞基因水平表达

表2 抑制NRF2 mRNA表达后，肝癌耐药细胞SMMC-7721-SR基因水平表达

表3 索拉非尼处理SMMC-7721细胞和SMMC-7721-SR细胞基因水平表达

表4 抑制NRF2 mRNA表达后，肝癌耐药细胞SMMC-7721-SR基因水平表达