超高效液相色谱-串联质谱法测定谷物制品中18种真菌毒素

丘福保，卢丽明，林胜军，刘国平

中山市疾病预防控制中心 (中山 528400)

真菌毒素(mycotoxins)是一类由丝状真菌在一定的环境条件下产生的次级代谢产物，已确认化学结构的真菌毒素有300多种，如黄曲霉毒素、伏马毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2和HT-2毒素等，大部分被证实具有致癌、致畸和致突变作用，其中黄曲霉毒素B1被公认为市目前致癌作用最强的天然物质之一[1]。真菌毒素对谷物及其制品的污染具有普遍性，是比合成污染物、植物毒素、食品添加剂或农药残留更为重要的食源性风险因子。我国现行食品中真菌毒素限量标准(GB 2761—2017[2])规定谷物及其制品中黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的最高允许限量，对其他特殊膳食用食品则有更为严格的要求。

真菌毒素的快速筛查多用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)[3-4]，具有简单快速和成本低的优点，但定量能力差且容易出现假阳性情况。准确定性定量方面主要有气相色谱法(gas chromatography，GC)[5-6]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[7-8]和液相色谱质谱联用法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)，前两种多用于一种或同一类真菌毒素的定性或定量分析，常需要将真菌毒素衍生化处理，操作颇为复杂且灵敏度相对较低，而谷物及其制品中的真菌毒素污染往往是多种毒素同时存在，液相色谱质谱联用法因灵敏度高、可以多组分同时测定而常用于多真菌毒素检测研究[9-15]。

样品在前处理过程中加入同位素内标可以减小基质效应的影响，提取液直接稀释后上机在结果计算时容易出现偏差[13]，利用固相萃取柱或免疫亲和柱净化时检测成本较高且回收率未能全面兼顾到各真菌毒素。本研究通过优化前处理、色谱和质谱条件，建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定谷物制品中的18种真菌毒素，可为食品安全风险监测中多种真菌毒素检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器和设备

LC-30AD超高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司)；6500+超高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(美国AB Sciex公司)；Milli-Q Element超纯水制备仪(美国Millipore公司)；千分一电子天平(感量0.001 g，日本SHIMADZU公司)；Real Mix涡旋振荡器(德国Heidolph公司)；3-30K低温超高速离心机(德国Sigma公司)；N-EVAP-112氮吹仪(美国Organomation公司)；FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；20目样品筛(浙江上虞市道墟五四仪器纱筛厂)。

1.1.2试剂

黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFT B1)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFT G1)浓度为2.00 mg/L，黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFT B2)、黄曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFT G2)、黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFT M1)浓度为0.500 mg/L，赭曲霉毒素A(orchatoxin A，OTA)浓度为10.0 mg/L，伏马毒素B1(fumonisin B1，FB1)、伏马毒素B2(fumonisin B2，FB2)、伏马毒素B3(fumonisin B3，FB3)、去环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deepoxy deoxynivalenol，DOM)浓度为50.0 mg/L，T-2毒素(T-2 toxin，T-2)、HT-2毒素(HT-2 toxin，HT-2)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol，3-AcDON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl-deoxynivalenol，15-AcDON)、瓜萎镰刀菌烯醇(nivalenol，NIV)、镰刀菌烯酮(fusarenon-X，Fus X)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)浓度为100 mg/L，以及同位素内标U-[13C17]-黄曲霉毒素B1、U-[13C17]-黄曲霉毒素B2、U-[13C17]-黄曲霉毒素G1、U-[13C17]-黄曲霉毒素G2、U-[13C17]-黄曲霉毒素M1浓度为0.500 mg/L，U-[13C20]-赭曲霉毒素A、U-[13C34]-伏马毒素B2、U-[13C34]-伏马毒素B3浓度为10.0 mg/L，U-[13C24]-T-2毒素、U-[13C22]-HT-2毒素、U-[13C34]-伏马毒素B1、U-[13C15]-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、U-[13C15]-3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、U-[13C15]-瓜萎镰刀菌烯醇、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮浓度为25.0 mg/L(纯度均大于99%，奥地利Romer Labs公司)；甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，德国Merck公司)；实验用水均为超纯水。

1.2 方法

1.2.1标准溶液的配制

分别移取一定体积上述各标准储备液配制适宜的混合标准中间液和混合同位素内标中间液，然后用20%乙腈-水溶液逐级稀释，混合中间液和标准曲线浓度如表1所示，现配现用。

表1 18种真菌毒素混合中间液和标准曲线浓度

1.2.2样品前处理

称取2 g(精确至0.001 g)经24 000 r/min高速粉碎并过20目样品筛(孔径0.850 mm)的谷物制品样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸溶液(80∶19∶1，v/v/v)涡旋振荡提取30 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液2 mL氮吹浓缩至干，加入50 μL同位素内标混合中间液和950 μL 20%乙腈水溶液溶解残渣后转入1.5 mL带盖离心管中14 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm水系微孔滤膜后上机测定。

1.2.3仪器条件

色谱：色谱柱，Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相，正离子模式以0.1%甲酸水溶液为水相，负离子模式以超纯水为水相(A)，乙腈为有机相(B)；梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

质谱：电喷雾离子(electrospray ionization，ESI)源：正离子、负离子分别扫描；多反应监测模式(MRM)；离子源温度：500 ℃；气帘气：9 psi；碰撞气：30 psi；电喷雾电压，正离子模式5 000，负离子模式-4 500；雾化气：40 psi；辅助气：40 psi。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

通过针泵对18种真菌毒素的标准溶液进行流动注射分析，分别在ESI+和ESI-离子化模式下进行全扫描(Q1 Scan)选择合适的母离子，然后在一定的碰撞能量下扫描碎片离子(Product Ion Scan)，选择相对丰度最高的碎片离子作为定量离子，次高的作为定性离子，在多反应监测模式(multi-reaction monitoring，MRM)再优化各离子对的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能量(collision energy，CE)。大部分真菌毒素以[M+H]+或[M-H]-作为母离子，而T-2、HT-2及其相应的同位素内标则以[M+Na]+离子响应较高，得到18种真菌毒素及其内标的质谱参数和色谱保留时间t见表3。

表3 18种真菌毒素及15种内标的质谱参数

2.2 色谱条件的优化

本试验考察了超纯水、0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸铵溶液和含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液作为水相与甲醇、乙腈作为有机相的不同组合对各真菌毒素离子化效率的影响。结果发现，在正离子模式下甲酸的浓度加大时伏马毒素的响应灵敏度随之升高，而黄曲霉毒素则刚好相反；乙酸铵的加入对大部分真菌毒素的峰形没有明显改善作用；乙腈作为有机相时比甲醇洗脱能力强，峰形较窄且总分析时间相应缩短。因此，最终选择乙腈作为有机相，0.1%甲酸水作为正离子模式水相，超纯水作为负离子模式水相。

本试验还分别考察了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)3种色谱柱对18种真菌毒素的分离效果。结果显示HSS T3分离效果优于另外两种色谱柱，特别是对同分异构体FB2和FB3的分离。浓度点5的11种正离子总离子流色谱图和7种负离子总离子流色谱图如图1和图2。

注：真菌毒素及其内标按出峰时间顺序依次为：1.AFTM1；2.AFTG2；3.FB1；4.AFTB2；5.AFTG1；6.AFTB1；7.FB3；8.HT-2；9.FB2；10.T-2；11.OTA。

注：真菌毒素及其内标按出峰时间顺序依次为：1.NIV；2.DON；3.DOM；4.Fux X；5.15-AcDON；6.3-AcDON；7.ZEN。

2.3 前处理条件的优化

乙腈的极性强于甲醇，文献中多数用乙腈-水溶液提取样品中的真菌毒素，且少量甲酸的加入有利于FBs和OTA等含羟基化合物的提取[13]，本试验以挂面样品作为本底考察了不同比例的乙腈-水-甲酸溶液对提取效率的影响。结果表明，随着提取溶剂中乙腈比例的提高，各真菌毒素的提取回收率有相对集中的趋势。乙腈-水比例在80%时，多数真菌毒素的提取回收率较为合适。最终选择提取溶剂为乙腈-水-甲酸(80∶19∶1，v/v/v)。

2.4 方法学验证

2.4.1线性关系、检出限和定量限

按1.2.1方法配制混合标准溶液系列，以同位素内标法定量。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分别计算各真菌毒素的检出限和定量限，称样量以2 g计，结果如表4所示。

表4 18种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4.2回收率和精密度

选取挂面、方便面和米粉三种不同基质的样品分别加入线性范围内低、中、高3个浓度水平的18种真菌毒素混合标准溶液，按1.2.2方法处理后上机测定，每个加标水平平行试验3次。扣除样品本底值后计算各自的平均加标回收率和室内精密度，结果见表5。

表5 不同样品基质中18种真菌毒素的平均回收率和室内精密度(n=3)

2.4.3准确度

本试验测定了几份购于Romer labs公司的玉米粉/小麦粉质控样，结果如表6所示，目标真菌毒素的测定值均在质控样的给出的参考值范围内。

表6 质控样品检测结果(n=2)

2.5 实际样品检测

采用优化后的前处理条件和UPLC-MS/MS方法检测市售的挂面、方便面和米粉各10份。结果显示，方便面中检出有AFTB1、FB1、DON和NIV，挂面和米粉检出有DON和NIV，其他真菌毒素均未检出，其中有2份挂面和1份方便面的DON含量超过了限量值标准(1 000 μg/kg)。检测结果还显示当DON含量较大时常常NIV也会随之检出，且DON的含量大概是NIV的十几倍。说明DON对谷物制品的污染具有普遍性，可能与农作物的储存和加工环境有一定的关系。

3 结论

本试验通过优化色谱、质谱条件结合提取后浓缩和同位素内标校正技术，建立了分析谷物制品中18种真菌毒素的超高效液相色谱-串联质谱方法。该方法具有灵敏度高、前处理成本较低，适用于多种真菌毒素定性和定量检测，能够满足日常食品安全风险监测的检测需求。