生活饮用水中大肠埃希氏菌实验室检测探讨

黄英哲

（宾阳县疾病预防控制中心检验科 广西 南宁 530400）

水样中的细菌包括很多属和很多种，我国《生活饮用水卫生标准》2006版[1]的卫生学评价标准是以菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌4 项作为微生物指标。三种大肠菌群的逻辑关系如下：总大肠菌群＞粪大肠菌群＞大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌，是总大肠菌群、(耐热)大肠菌群的主要种类。大肠埃希氏菌被检出，表示水体受到肠道致病菌污染的可能性更大[2]。

生活饮用水微生物指标除了与外界条件有关外，实验室检测内部质量控制也至关重要[3]。只有做好实验室质部质量控制，才能保证检测对象结果真实可靠。为了检验本实验室大肠埃希氏菌检测能力，本实验室按照GB/T5750.12－2006 大肠埃希氏菌多管发酵法，开展了生活饮用水中大肠埃希氏菌检测的质控活动，质控活动达到如下目标：

1）使用工作中发现的耐热大肠菌群、标准菌株产气肠杆菌、标准菌株大肠埃希氏菌三种菌进行试验，观察不同大肠菌群在EC-MUG 培养基荧光效果，取得阳性标本荧光视觉效果。

2）对使用的试管酸浸泡、水龙水直接清洗处理两种清洗方法，寻找影响大肠埃希菌荧光效果因素。

3）使用北京EC-MUG 培养基陆桥试剂及青岛海博EC-MUG 培养基试剂进行比较试验，检验实验室常规使用的试剂厂家是否优良。

1.材料与仪器

1.1 EC-MUG 培养基，北京陆桥（批号171220）、青岛海博（批号20190610）。

1.2 伊红美兰培养基，购自北京陆桥有限责任公司。

1.3 培养箱，36℃±1℃;44.5±0.5℃;波长366nm 紫外灯。

2.方法与结果

2.1 方法原理

EC-MUG 培养基检测大肠埃希氏菌是指:大肠埃希氏菌能特异性产生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)，此酶能分解培养基上的MUG 荧光底物释放出荧光产物，使培养基在366 nm 紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌。

2.2 实验设计

2.2.1 蒸馏水、酸浸泡分别处理试管，蒸馏水清洗试管组分别分装蒸馏水（空白对照）、产气肠杆菌（阴性对照）、耐热大肠菌（干扰对照）、大肠埃希菌（阳性对照）；酸浸泡试管组分别分装蒸馏水（空白对照）、产气肠杆菌（阴性对照）、耐热大肠菌（干扰对照）、大肠埃希菌（阳性对照）。检查不同清洗条件下影响实验荧光效果因素。

2.2.2 北京陆桥、青岛海博两种不同品牌的EC-MUG 培养基，在鉴定产气肠杆菌（阴性对照）、大肠埃希菌（阳性对照）荧光效果，检验两种不同品牌在检测大肠埃希氏菌的优劣。

2.3 操作步骤

在总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸产气或产气的管进行大肠埃希氏菌检测。用无菌金属环将前述试管中液体接种到EC－MUG 管中。44.5℃培养24 小时，将培养物在暗处用波长为366nm 功率为6W 的紫外灯照射观察结果（以下暗室下观察结果均为366nm 功率为6W 的紫外灯照射观察）。

2.4 结果

以下结果均为总大肠菌群多管发酵法基础上，用无菌金属环将前述试管中液体接种到EC－MUG 管中。44.5℃培养24 小时不同环境条件下的观察结果。

2.4.1 蒸馏水（空白对照）、产气肠杆菌（阴性对照）、耐热大肠菌（干扰对照）、大肠埃希菌（阳性对照）各自对应的蒸馏水清洗试管、酸浸泡过的试管组成两两对照荧光观察结果见表1。

表1 不同清洗条件下，暗室下366nm 功率为6W 的紫外灯照射荧光效果观察结果

结果说明：（一）蒸馏水清洗的试管及酸浸泡的试管，在各类对照实验组，他们肉眼观察实验现象是没有差别的。正常的清洗不是影响各组实验结果的因素。（二）空白组明显为暗室底色，其他对照组均有明显的乳白荧光。（三）两两荧光效果比较：阳性对照组荧光明亮，阴性组比较暗淡，差别明显（如图2）；阴性对照组和干扰组荧光效果无明显差别（如图1）。

2.4.2 蒸馏水（空白对照）、产气肠杆菌（阴性对照）、耐热大肠菌（干扰对照）、大肠埃希菌（阳性对照）在不同观察环境下，荧光观察结果见表2。

表2 不同观察条件下的实验荧光效果对照表

结果说明：（一）蒸馏、产气肠杆菌在44.5℃培养24 小时均为清亮，但没有混浊，预示没有细菌繁殖；耐热大肠菌群、大肠埃希菌液体混浊，44.5℃培养24 小时均有菌生长。（二）产气肠杆菌与耐热肠菌杆菌荧光效果一致，大肠埃希菌有区别于其他组别的荧光或颜色反应。（三）、产气肠杆菌、耐热大肠菌、均有比较明显的荧光干扰。应设置空白对照、阳性对照，鉴别阴阳结果（图1、图2）。

2.4.3 蒸馏水（空白对照）、产气肠杆菌（阴性对照）、耐热大肠菌（干扰对照）、大肠埃希菌（阳性对照）在北京陆桥、青岛海博生产的EC－MUG 管实验结果，荧光观察见表3。

表3 暗室下366nm 功率为6W 的紫外灯照射荧光效果观察结果

通过产气肠杆菌与实验室耐热大肠菌群在EC-MUG 高温培养后的荧光效果比较。产气肠杆菌在高温中不能生长，液体清亮，也不能分解荧光底物。

3.讨论

3.1 有关文献及实验结果中[4]，试管本身会产生微量荧光。本次实验使用的试管分两部分，一部分是用酸浸泡试管七天以上，然后进行蒸馏水清洗；另一部分是直接用水龙头水直接清洗，两类试管均165℃2 小时以上高温灭菌。同一菌株在不同方法处置的试管，实验效果无差别，说明一般试管可能产生的荧光对实验没有影响。

3.2 EC-MUG 培养基试剂本身经培养后会溢出一定的荧光物质，如果没有阳性对照作比较，可能会误以为是真阳性，造成假阳性结果。因此，初级实验者或日常工作中，应带标准菌株同步实验并观察实验结果。

3.3 两家试剂厂家生产的EC-MUG 培养基，阳性结果产生荧光效果均显著，实际操作中，日常生活饮用水中的大肠埃希氏菌试验结果与阴性对照相差无异时，可以按未检出大肠埃希氏菌结果进行报告。

3.4 GB/T5750.12－2006 检测大肠埃希氏菌有多管发酵法、滤膜法、大肠埃希氏菌酶底法。推荐的第一法为多管发酵法，采用多管发酵法和酶底物法对大肠埃希氏菌进行检测，检出结果基本一致[5]。在日常生活饮用水监测中，第一法相对第二法过滤法更简便易行；相对第三法酶底法来讲，更经济实惠。因此，第一法多管发酵法，在常规检测工作中仍是值得推广的方法。

3.5 不同稀释度的大肠埃希氏菌液在EC-MUG 培养液中，产生荧光效果无显著区别。因此，总大肠菌发酵后，在下步实验操作中，移液管要一管一用，不同发酵管不能出现交叉污染，防止阳性值偏高。